一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法

本发明涉及一种提高豆科植物共生固氮能力的方法，属于微生物。

背景技术：

1、在大豆的农业生产中，大豆高产受多因素影响，包括基因型、共生根瘤菌、生物物理环境和农艺管理等。其中共生固氮是一个重要的过程，与大豆的高产密切相关。大豆对氮素需求量大，共生固氮能力能满足其生长需要，同时减少对工业氮肥的依赖，有助于提高土壤微生物活性和改善土壤性质。为了更好地利用共生固氮，各国加强了理论和技术的研究，其中根瘤菌剂引起了广泛关注。

2、根瘤菌与大豆建立共生关系，形成根瘤，通过固氮将空气中的氮素转化为植物可利用的氨态氮。这过程中，根瘤菌的应用可以提高大豆的氮素供应，增加产量。根瘤菌剂的研究通过先进的分子研究技术对根瘤菌进行鉴定分类，挖掘出更多根瘤菌资源。

3、根据宿主植物特异性和共生基因的系统发育类型，根瘤菌可分为不同的属，如固氮根瘤菌属(azorhizobium)、慢生根瘤菌属(bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)、根瘤菌属(rhizobium)和中华根瘤菌属(sinorhizobium)。

4、豆科植物面临环境压力，而根瘤菌需要适应共生宿主和环境的双重选择。只有适应当地环境的根瘤菌菌株才能得以保留。因此，豆科植物与根瘤共生关系的形成是通过宿主植物、调控共生效应的关键基因、环境因素等多方面协调形成的，表现出多样性和混杂性。在主栽大豆品种推广的生态区内筛选出高亲和力的根瘤菌是实现田间高效共生固氮的有效方法之一。

5、由于不同生态区的大豆品种和根系微生物菌群存在差异，外添加的根瘤菌剂效果难以达到预期。目前，国内根瘤菌剂的使用面积不到大豆种植面积的8％。这主要是因为缺乏与主栽品种匹配的高效根瘤菌资源，根瘤菌接种技术效率低，而且对大豆产量有一定的影响。

6、因此，筛选与地方主栽大豆品种高亲和力、适应当地条件的大豆根瘤菌变得至关重要。这有助于确保根瘤菌剂的适应性，提高共生效果，最终促进大豆的高产。

技术实现思路

1、本发明为解决现有根瘤菌接种技术效率低，而且对大豆产量有一定影响的问题，进而提供一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法。

2、为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：

3、本发明的步骤包括：

4、步骤1、分离和纯化根瘤菌；

5、步骤2、提取根瘤菌总dna,扩增16s?rdna基因序列，并在ncbi网站上进行基因序列比对；

6、步骤3、根瘤菌的回接结瘤。

7、优选的，步骤1中分离和纯化根瘤的步骤包括：

8、步骤101、在超净工作台中，用灭菌消毒过的剪刀剪取新鲜饱满的根瘤，将根瘤放入无菌水中清洗3～5次，洗净根瘤表面污渍；

9、步骤102、将根瘤先放入消毒液中消毒，无菌水反复冲洗数次，直至根瘤表面药剂清洗干净；

10、步骤103、用灭菌消毒后的刀子将根瘤对半切开，露出根瘤菌内部结构，用消毒后的镊子把根瘤夹住，在yma培养基上进行划线；

11、步骤104、通过菌落形态、粘性、色泽、边界等表观特征，选取符合根瘤菌菌落特征的菌落进行平板划线分离多次，直至单菌落表型上一致，初步获得纯化的单菌落。

12、优选的，步骤102中将根瘤先放入无水乙醇浸泡消毒3～5min，再放入3.5％naclo消毒8min。

13、优选的，步骤103中划线好的培养基放入28℃恒温培养箱中培养，2～3d后长出清晰的菌落。

14、优选的，步骤2中提取根瘤菌总dna的步骤包括：

15、步骤201、通过tianamp?bacteria?dna?kit细菌基因组dna提取试剂盒提取分离纯化好的根瘤菌总dna；

16、步骤202、然后再通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，参照已有的根瘤菌16s?rdna基因保守区扩增的序列引物对根瘤菌总基因组dna为模板进行pcr扩增，检测出目的基因条带；

17、步骤203、最后，将pcr产物进行测序。

18、优选的，步骤3中根瘤菌的回接结瘤是通过如下步骤实现的：

19、步骤301、制备菌悬液；

20、步骤302、盆栽基质；培养基质采用的蛭石在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min；

21、步骤303、结瘤实验；

22、步骤304、共生指标测定。

23、优选的，步骤301中制备菌悬液的步骤包括：

24、步骤3011、将大豆根瘤菌jms3-5-1在带有抗性的yma平板上进行划线，于28℃恒温培养箱中培养至清晰的菌落长出；

25、步骤3012、同时选取慢生根瘤菌usda110及快生根瘤菌hh103作为对照；

26、步骤3013、在各个类型根瘤菌平板中挑取少许菌落放入yma液体培养基中，28℃振荡培养，离心收集其菌体，无菌水重悬菌液至od值为0.8～1.0，制成菌悬液。

27、优选的，步骤303中结瘤实验的步骤为：将大小一致，新鲜饱满的黑河43种子，用无菌水清洗干净，吸附于浸水的灭菌滤纸上放置温室中萌发；1～2d后，选取健壮，长势一致的大豆幼苗栽种于盛有灭菌蛭石的盆钵中；用移液器沿各植株根部接种根瘤菌菌悬液；植物培养间温度保持在25℃；分别于接种后3d、18d以及28d收获调查其共生表型。

28、优选的，步骤304中共生指标测定的方法为：

29、根长：将根部用清水洗干净，用直尺测量从植物根茎的底部到根尖的长度，以cm为单位；

30、株高：用直尺测量从植物茎的顶部到底部的长度，以cm为单位；

31、根鲜重：将根部清洗干净吸干水分用电子天平称取根部重量，以g为单位；

32、植株地上部分鲜重：用电子天平称取大豆植株地上部分的鲜重，以g为单位；

33、根瘤数：将每株大豆植株根部用清水洗干净，再将根瘤小心剥下，计数；

34、本发明的有益效果是：

35、1、本发明提供的利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法能显著促进植株株高和根长的生长，还提升植株鲜重和根鲜重，能够有效促进大豆结瘤数量，达到促生增产的效果。

36、2、上述技术方案在黑龙江省农科院佳木斯分院黑河43高产示范田，开展了根瘤菌(rhizobium?sp.)jms3-5-1在大田施用效应研究，效果良好，具有很好的开发应用前景。

37、3、本发明基于推广品种在示范推广区域田间高产、多抗以及高结瘤固氮的协同优异表型，筛选出与其高亲和力的高效根瘤菌。这一研究思路和结果为丰富根瘤菌菌种资源、指导大豆共生固氮的高效实施提供了重要的理论基础。

技术特征：

1.一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法，其特征在于，所述一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法是通过如下步骤实现的：

2.根据权利要求1所述的一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法，其特征在于：步骤1中分离和纯化根瘤的步骤包括：

3.根据权利要求2所述的一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法，其特征在于：步骤102中将根瘤先放入无水乙醇浸泡消毒3～5min，再放入3.5％naclo消毒8min。

4.根据权利要求2所述的一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法，其特征在于：步骤103中划线好的培养基放入28℃恒温培养箱中培养，2～3d后长出清晰的菌落。

5.根据权利要求1所述的一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法，其特征在于：步骤2中提取根瘤菌总dna的步骤包括：

6.根据权利要求1所述的一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法，其特征在于：步骤3中根瘤菌的回接结瘤是通过如下步骤实现的：

7.根据权利要求6所述的一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法，其特征在于：步骤301中制备菌悬液的步骤包括：

8.根据权利要求6所述的一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法，其特征在于：步骤303中结瘤实验的步骤为：将大小一致，新鲜饱满的黑河43种子，用无菌水清洗干净，吸附于浸水的灭菌滤纸上放置温室中萌发；1～2d后，选取健壮，长势一致的大豆幼苗栽种于盛有灭菌蛭石的盆钵中；用移液器沿各植株根部接种根瘤菌菌悬液；植物培养间温度保持在25℃；分别于接种后3d、18d以及28d收获调查其共生表型。

9.根据权利要求6所述的一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法，其特征在于：步骤304中共生指标测定的方法为：

技术总结
本发明提供一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法，属于微生物技术领域。所述一种利用大豆根瘤菌提高豆科植物共生固氮能力的方法是通过如下步骤实现的：分离和纯化根瘤菌；提取根瘤菌总DNA，扩增16S?rDNA基因序列，并在NCBI网站上进行基因序列比对；筛选出根瘤菌进行回接结瘤。本发明所提供的方法具有促进大豆植株生长的作用，其促进作用体现为使大豆结瘤数、株高和根长增加，而且还提升植株鲜重和根鲜重，在促进大豆的栽培生产方面具有重要的应用价值。

技术研发人员：周舒扬,甄涛,于德水,张丕奇,朱加楠,田爽,马银鹏,刘佳宁,郭燕,韩闯,戴肖东,马庆芳,叶阳
受?；さ募际跏褂谜撸?/b>黑龙江省科学院微生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29