一种种蛋开窗封窗方法与流程

本发明属于种蛋孵化领域，具体地，涉及一种种蛋开窗封窗的方法。

背景技术：

1、鸡胚开窗、封窗技术指的是将发育到一定时期的种蛋蛋壳开孔，对鸡胚进行显微注射，然后再将蛋壳封口，继续孵化的技术。该技术目前主要应用于以下三个方面：1)制备转基因鸡；2)利用禽类原始生殖细胞保存禽类种质资源；3)以鸡胚作为胚胎发育的动物模型研究基因或药物功能?？胺椒?、开窗工具、开窗位置及窗口大小、封窗材料等因素都会影响鸡胚发育及最终出壳率，具体如下：

2、1)开窗方法

3、开窗方法目前主要有代用蛋壳法和自身蛋壳法。关于代用蛋壳法，ono[1]于1984年报道了将孵化2.5天的鹌鹑胚胎转移到鸡蛋壳内培养，有3％的鹌鹑孵出；perry等[2]于1988年报道了建立禽类胚胎体外培养系统，将受体胚胎打开导入培养皿中，使胚盘暴露，注入供体胚胎细胞1-3μl，转入代用蛋壳进行孵化，72h之后再将胚胎蛋黄蛋清转入开口2cm双黄蛋的代用蛋壳，封口膜封口，最终出雏率为7％。关于自身蛋壳法，kown[3]等于2004年报道了将新产蛋用70％酒精擦拭消毒，用一个精密的钻孔器在鸡蛋赤道面上开一个4.5×4.5mm2的窗口，用精致的镊子和外科手术刀去掉窗口内的小壳膜。用微注射针将5μl含有浓缩病毒颗粒的dmem培养基注射进入了囊胚腔中央部分；微注射针由耐热玻璃管拉成，尖端内径为80μm；注射完后，窗口用薄膜封口，孵化率为8.3％。

4、2)开窗工具

5、开窗工具主要有钻孔器、手术刀片、自制开蛋工具、化学品腐蚀等。燕海峰等[4]用开蛋工具在鸡蛋赤道面部位开多边形或圆形切槽，通过窗口进行胚胎操作，将细胞液或其它物质注射入囊胚或发育一定时期的胚胎；剪一块比切块大的医用膜，以切块为中心直接贴上，稍用力抹平，再在医用胶带上涂上一层502胶水，转入孵化箱，最终孵化率高达50％以上。孙小美[3]等用浓盐酸腐蚀法对孵化三天的种蛋赤道面开窗，用蛋壳膜石蜡封口，第五天的鸡胚成活率为77％，但最终总出壳率该文献未提及。

6、3)开窗位置及窗口大小

7、开窗位置主要有尖端、赤道面、气室端。燕海峰等[4]于2008年报道，种蛋赤道面开窗最高孵化率可达65％，气室端开窗(针刺透内壳膜操作胚胎)方式，比赤道面开窗方式的孵化率明显提高，最高可达74％，但不适合需要精确操作的胚胎。kamihira[6]等于2005年报道，在种蛋尖端水平切去一部分，直径为35mm。注射病毒液1.5-3.5μl至鸡胚血管。培养3天后再转移到代用蛋壳，添加稀蛋清和乳酸钙悬液，最终孵化率63％。李赞东等[7]于1994年报道，鸡胚体外培养时，打开后的蛋壳切口部位在翻蛋过程中极易与发育中的胎膜粘连，造成胎膜破裂、胚胎死亡。采用尖端开口后大头朝上胚胎在上方，不容易与蛋壳开口处粘连。郝志明等[8]于2005年报道，随着开孔直径的增加，鸡胚孵化率呈下降趋势，开孔直径为0.5、1.0和1.5cm时的孵化率分别为80.0％、30.0％和16.7％。

8、4)封窗材料

9、封窗材料主要为封口膜、胶水、石蜡、贴纸等。研究表明，窗口处气体和水分的挥发会影响鸡胚发育，有可能导致胚胎发育畸形或死亡。封窗材料不严密会造成漏气，增加污染风险。

10、在现有的开窗技术中，种蛋开窗工具没有标准化，多为手工操作，如用手术刀或剪刀等进行的手工切割；或采用化学方法，如用低浓度盐酸腐蚀蛋壳。手工操作进行开窗的缺点在于窗口的大小、规格、形状不一致。形成的窗口粗糙形成锯齿，工具尖锐，这些都容易对胚胎造成伤害乃至死亡?；Х椒ê氖背?，化学试剂容易伤害胚胎。不同人员操作手法差异大，影响实验结果，产生的结果比较随机。

11、此外，现有的禽类胚胎蛋壳处理技术程序繁琐复杂，效率低，无法量产。如使用代用蛋壳，则操作复杂，增加污染几率，且成本高，不适合量产。

12、另外，现有技术一般采用封口膜、贴纸、胶水等材料进行封窗。在显微操作需要蛋壳开口较大的情况下，增加污染几率。另外，采用大面积异源材料对蛋壳进行封窗容易影响蛋壳透气率，进而影响胚胎发育。封窗不严则会导致漏液漏气，从而导致孵化率降低。

13、由于受多种因素影响及各因素之间的相互作用，开窗封窗后禽类胚胎存活率及出壳率的数据结果具有不稳定性和复杂性。此外，现有技术操作复杂，费时费力效率低，工具没有标准化，不适合自动化及批量生产。具体地，对禽类种蛋进行开窗的现有技术受技术要素、人员素质、试验条件局限，仅限于试验研究阶段，技术没有实现标准化，因此，无法大规模量产及推广，并且封窗材料不够稳定安全，操作不够简便易行，结果随机性强、不能重复。

14、因此，找出影响禽类胚胎存活率及出壳率的关键因素，提高孵化率，从而对现有技术进行改进仍是需要研究解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种新的种蛋开窗封窗方法，从而使得种蛋开窗封窗操作更加标准化，操作性更强，并且本发明提供的方法对禽类胚胎的伤害更小，出壳率更高。

2、具体地，根据本发明的第一方面，提供了一种种蛋开窗封窗方法，所述方法包括：1)利用印章在种蛋蛋壳上标记出供切割线条；2)沿所述供切割线条切割蛋壳和内壳膜，取下切割得到的带有内壳膜的蛋壳切片，以对所述蛋壳进行开窗；以及3)用粘合剂涂抹所述蛋壳切片，然后将所述蛋壳切片盖回原处以进行封窗。

3、本发明使用自身蛋壳和粘合剂进行封窗，这样的操作不仅实现了原有蛋壳的回收利用，而且保留了蛋壳的完整性，实现了对胚胎伤害的最小化，提高了出壳率。在本发明中，在没有引入外源物质的情况下，使用本发明提供的方法所实现的最大出壳率可达87.5％，平均出壳率可达70％以上。在对禽类胚胎进行外源物质注入时，使用本发明提供的方法所得到的禽类胚胎的出壳率也可达50％以上。此外，印章及开窗工具的使用可以使蛋壳开窗大小形状一致，这样便于高效、批量、快速操作，从而使得该方法的可操作性强，更标准化，且更适合自动化和批量生产。

技术特征：

1.一种种蛋开窗封窗方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述种蛋为来源于鸡、鸭、鹅、鹌鹑或鸽子的种蛋。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述供切割线条形成任何形状，例如多边形如三角形、四边形、五边形，圆形，或椭圆形。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述印章还同时在种蛋蛋壳上标记出与所述供切割线条相交的至少一条定位线条。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述供切割线条形成直径为5mm-15mm、优选10mm的圆形。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，在种蛋蛋壳尖端或蛋壳赤道面、优选蛋壳尖端处进行标记和开窗。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述粘合剂为硅胶，优选地，所述硅胶为食品级硅胶。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在步骤2)和3)之间的步骤2’)：对种蛋内的胚胎进行操作以取出其中的一部分细胞或者组织和/或向种蛋内的胚胎注入例如通过显微注射注入外源物质。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述外源物质为其它禽类或同种的其它品种的干细胞、经基因编辑的细胞、基因或药物。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括步骤4)：将封窗后的种蛋进行孵化。

技术总结
本发明提供了一种种蛋开窗封窗方法，所述方法包括：1)利用印章在种蛋蛋壳上标记出供切割线条；2)沿所述供切割线条切割蛋壳和内壳膜，取下切割得到的带有内壳膜的蛋壳切片，以对所述蛋壳进行开窗；以及3)用粘合剂涂抹所述蛋壳切片，然后将所述蛋壳切片盖回原处以进行封窗。本发明使用原蛋壳进行封窗，这样的操作不仅实现了原有蛋壳的回收利用，而且保留了蛋壳的完整性，实现了对胚胎伤害的最小化，提高了出壳率。此外，印章及开窗工具的使用可以使蛋壳开窗大小形状一致，这样便于高效、批量、快速操作，从而使得该方法的可操作性强，更标准化，且更适合自动化和批量生产。

技术研发人员：宋永宏,刘鹏,陈莉娜,王佳明,赖晓云
受?；さ募际跏褂谜撸?/b>威奥福生物科技（宁波）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24