一种ac4C乙?；奘蔚骺豏NA剪接的方法

本发明涉及生物，具体涉及一种ac4c乙?；奘蔚骺豶na剪接的方法。

背景技术：

1、rna剪接是在前体mrna中，在核酸内切酶作用下剪切掉内含子，然后再连接酶作用下，将外显子各部分连接起来，生成成熟mrna的过程，rna剪接是基因调控中的一个重要部分。通过rna剪接，可以产生许多具有功能的，带有编码信息的mrna，它对生物的发育及进化至关重要。

2、迄今为止，在rna上已发现了100多种化学修饰，如m6a（n6-methyladenosine），m1a（n1-methyladenosine），m5c（5-methylcytidine），hm5c（5-hydroxylmethylcytidine），i（inosine）以及ψ（pseudouridine）等化学修饰。ac4c乙?；奘问侵诙鄏na修饰的一种，但目前对ac4c修饰的研究较少。

3、目前的rna修饰影响rna剪接的检测技术主要包括rt-pcr，rt-qpcr以及northernblot等实验方法，以此来检测宿主或病毒的rna剪接水平的变化。在现有的rna剪接检测技术中，rt-pcr，rt-qpcr技术需要将提取的rna进行逆转录，再进行pcr或qpcr扩增，其不能直接分析rna的剪接，而且需要pcr扩增，该过程受退火温度，延伸时间以及扩增循环数等多个因素影响，从而造成实验结果的偏移，对于最终rna剪接的水平并不能真实反应；而northern?blot技术是使用靶基因的序列设计不同剪接位置的探针，将提取的rna通过电泳、转膜和显影等过程最终呈现rna剪接水平的变化，该过程比较繁杂，显影信号差，灵敏度低，导致结果的差异性不显著；以上检测方法操作过程繁杂，实验结果因多个影响因素产生偏移，缺乏真实性，灵敏度低，导致结果不理想。除此之外，rnase?protection?assay（rpa）技术在调控rna剪接上也有少部分的应用，但对于rpa技术在rna修饰调控rna剪接上并没有进行深入的研究和探索。

技术实现思路

1、为解决现有技术中，调控rna剪接方法的步骤繁琐，灵敏度低，导致实验结果不理想的问题，本发明的主要目的在于提供一种ac4c乙?；奘蔚骺豶na剪接的方法。该方法构建乙?；奘蔚膔na基因，并设计了特异rna探针，将特异rna探针与待测rna基因特异性结合，形成双链rna，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，通过磷屏成像系统检测被?；さ奶秸氲男藕?，从而定量ac4c修饰对rna剪接的影响。该方法操作简单，灵敏度高，能够定量反映ac4c乙?；奘蔚骺豶na剪接的水平。

2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

3、一种ac4c乙?；奘蔚骺豶na剪接的方法，包括以下步骤：

4、（1）制备特异rna探针：使用t7转录酶合成32p标记的rna探针；

5、（2）将rna探针与待测rna基因特异性结合，形成双链rna；

6、（3）双链rna进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，通过磷屏成像系统检测被?；さ奶秸氲男藕??实现ac4c修饰对rna剪接的定量分析；

7、进一步，所述的待测rna基因选自：构建乙?；竛at10的敲低或过表达细胞系，病毒感染48h后收取的细胞总rna，或者使用ac4c位点突变的感染性克隆转染细胞48h后收取的细胞总rna中的一种。

8、进一步，所述的待测rna基因选自?mvc病毒(genbank?accession?no.?fj214110)。

9、进一步，所述的t7转录酶来自megashortscriptt7转录试剂盒。

10、进一步，所述32p标记的特异rna探针的制备，包括以下步骤：

11、（1）dna模板制备：构建包含病毒基因探针序列的质粒，酶切线性化，纯化dna模板；

12、（2）rna探针制备：使用t7转录酶合成32p标记的rna探针（体系采用如下条件），然后加入dnase1，消化15分钟，去除dna模板；

13、

14、（3）rna探针纯化：在上述体系加入无水乙醇，沉淀rna，随后离心，加入rpa?缓冲液，重悬rna。

15、进一步，所述rpa?缓冲液成分为：pipes?0.134g，0.5m?edta（ph8.0）20μl，5m?nacl0.8ml，甲酰胺8ml。

16、相比现有技术，本发明所述的ac4c乙?；奘蔚骺豶na剪接的方法具有以下优势：

17、1、本发明通过改变乙?；竛at10的表达或者使用ac4c位点突变病毒，并结合rpa实验，更加真实的反应宿主或病毒rna的剪接水平，避免了逆转录和pcr扩增过程带来的实验结果的偏移。

18、2、本发明实验过程简单，实验结果的灵敏度高，差异显著，从而更好的呈现ac4c乙?；奘蔚骺豶na的剪接水平。

技术特征：

1.一种ac4c乙?；奘蔚骺豶na剪接的方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的ac4c乙?；奘蔚骺豶na剪接的方法，其特征在于：所述的待测rna基因选自：构建乙?；竛at10的敲低或过表达细胞系，病毒感染48h后收取的细胞总rna，或者使用ac4c位点突变的感染性克隆转染细胞48h后收取的细胞总rna中的一种。

3.根据权利要求1所述的ac4c乙?；奘蔚骺豶na剪接的方法，其特征在于：所述的待测rna基因选自mvc病毒。

4.根据权利要求1所述的ac4c乙?；奘蔚骺豶na剪接的方法，其特征在于：所述特异rna探针的制备，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的ac4c乙?；奘蔚骺豶na剪接的方法，其特征在于：所述rpa缓冲液成分为：pipes?0.134g，0.5m?edta（ph8.0）20μl，5m?nacl?0.8ml，甲酰胺8ml。

技术总结
本发明提供了一种ac4C乙?；奘蔚骺豏NA剪接的方法，通过构建乙?；奘蔚腞NA，设计了标记的特异RNA探针，将RNA探针与待测RNA基因特异性结合，形成双链RNA，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，通过磷屏成像系统检测被?；さ奶秸氲男藕?，从而定量分析ac4C修饰对RNA剪接的影响。该方法操作简单，灵敏度高，通过改变乙?；窷AT10的表达或者使用ac4C位点突变病毒，能够定量反映ac4C乙?；奘蔚骺豏NA剪接的水平。

技术研发人员：关武祥,张雪艳,黄方,陈珍
受?；さ募际跏褂谜撸?/b>中国科学院武汉病毒研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24