一种炎症响应型引导组织再生膜的制备方法与流程

本发明属于材料表面改性领域，具体涉及一种炎症响应型释放抗炎药物膜的制备方法。

背景技术：

异位骨化(heterotopicossification，ho)是指关节周围软组织中出现成熟的板层状骨的现象?？梢鸶丛有郧蛱弁醋酆险?、关节僵硬、神经嵌压等并发症。迄今为止对于ho的发病机理尚不明晰。但现有研究认为异位骨的形成与软组织内的间充质干细胞向成骨细胞的不正当分化有关。对于术后异位骨的生成来说，局部炎症反应引发的局部环境变化是促使这种不正当分化的至关重要的因素^【1】。

ho是全人工间盘置换术(tdr)后并发症中发病率较高的一种。通过对颈椎间盘置换术后ho发生率的meta分析显示：术后12个月和24个月的合并发病率为44.6％和58.2％，其中重度ho的发病率分别为11.1％和16.7％^【2】。较传统的椎间融合术来说，开展人工间盘置换术的意义核心在于维持脊柱可动性，而间盘假体周围异位骨化的发生无疑阻碍了这项技术的推广。如何有效降低人工颈椎间盘置换后异位骨化的发生率是临床亟待解决的问题。

人工椎间盘置换术后，必定伴有局部炎症的发生，组织损伤部位的坏死细胞释放危险信号，固有免疫系统的细胞识别信号，导致一些细胞因子、炎性因子及炎性介质的释放。这些因子协同作用，诱导间充质干细胞向成骨细胞的不正当分化，从而导致异位骨的生成。其中，转化生长因子tgf-βs、骨形态发生蛋白bmps及前列腺素2(pge2)被认为在诱导间充质干细胞向成骨细胞分化过程中起关键作用。

目前临床还没有预防抑制人工颈椎间盘置换术后ho的有效手段，普遍采用局部放射治疗和口服非甾体类消炎药(non-steroidanti-inflammatorydrug，nsaids)的方法。放疗的作用机制是通过改变快速分化细胞的dna结构，阻止多能间充质干细胞向成骨细胞的分化，从而抑制ho的发生。然而，放疗预防ho局限性很大，容易引发癌变、导致骨不连以及影响生殖能力等?？诜saids是目前预防术后异位骨化发生所采用的最普遍和最有效的方法。研究表明术前使用nsaids能将术后ho发生率降低约57％-59％?？诜saids预防术后ho的方法简单，治疗成本相对较低，因此得到了较为广泛的应用，但其副作用也十分明显，主要表现为消化道溃疡，约20-37％的患者因为胃肠道反应而不能完成治疗，其次，还会引起肝脏、泌尿和血液系统的不良反应。此外，颈椎间盘置换术后异位骨化的临床表现最早出现于术后3周，也有术后半年，甚至1年后出现的报道，具有较大的临床个体差异性。而目前采用的放疗或口服nsaids一般都是在围手术期进行干预，无法针对个体差异性预防抑制。

当炎症发生的时候，会有大量的巨噬细胞聚集，聚集的巨噬细胞会分泌大量的胆固醇酯酶(cholesterolesterase，ce)，并且感染越严重释放的ce量越多，而ce对酰胺键及酯键具有选择性酶解作用。将药物通过酯键接枝到膜表面，对炎症发生过程中产生的酶具有响应性。当炎症发生时，酯键在酶的作用下断裂，药物释放；炎症程度越高，周围聚集的巨噬细胞越多，释放的酶越多，从而释放的药物的量就越多。利用ce对酯键的选择性酶解，将药物分子通过酯键固定在膜表面，且连接药物的酯键的含量达到一定数量，就可能构建炎症响应型释放药物的膜。从而达到针对不同患者发病时间及严重程度的差异，高效针对性预防抑制炎症的目的。

参考文献：

[1]balbonita，gobezier，mamonhj，heterotopicossification：pathophysiology，clinicalfeatures，andtheroleofradiotherapyforprophylaxis.int.j.radiationoncologybiol.phys.，2006，65：1289–1299.

[2]chenj，wangxw，baiws，shenxl，yuanw.prevalenceofheterotopicossificationaftercervicaltotaldiscarthroplasty：ameta-analysis：eurspinej，2012，21：674-680.

技术实现要素：

本申请针对现有预防抑制术后异位骨化发生方法的局限性，提出将临床常用非甾体类抗炎药物以酯键固定在植入膜材料表面，利用炎症巨噬细胞释放的ce对酯键的选择性酶解作用，实现通过炎症反应的程度控制调节nsaids释放的目的，从而达到克服目前临床普遍口服nsaids造成的严重副作用，局部高效预防抑制术后异位骨化发生的目的。

1.一种炎症响应型膜的制备方法，其特征是：高分子膜为基体材料，通过紫外光引发，将itxsp休眠种引入到高分子膜表面；通过紫外光引发，激活itxsp休眠种，在激活表面同时加入引发剂、交联剂及烯醇类单体，从而在膜表面接枝上一层水凝胶层，改变膜表面的水溶性；将带羧基的抗炎药物与烯醇类单体反应，形成含酯基及碳碳双键的单体；最后将该含酯基及碳碳双键的单体、烯醇类单体、交联剂，在热引发剂的引发下，在膜表面上再加载上一层含有药物的凝胶层，其中药物以酯键固定在凝胶层中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其具体操作步骤为：

(1)将itx丙酮饱和溶液涂覆在高分子膜表面，盖上石英板，通过紫外引发，将itxsp官能团引入高分子膜表面，得到载有itxsp官能团的聚合物膜；

(2)烯醇类单体与带羧基抗炎药物在dcc/dmap(n,n'-二环己基碳酰亚胺/4-二甲氨基吡啶)催化下进行酯化反应，从而得到含药物、酯键及双键的单体，将得到的单体记为drug；dcc/dmap即为n,n'-二环己基碳酰亚胺/4-二甲氨基吡啶，其中反应单体与引发剂的投料摩尔比为idcm:hemaa:dcc:dmap＝1:3:3:0.5，

(3)将引发剂，交联剂及含酯基及碳碳双键的单体按照摩尔比＝1:1:5，浓度10-30wt％配制成溶液；在载有itxsp官能团的聚合物膜表面，涂覆该溶液，盖上石英板，通过紫外光引发，从而在该高分子膜表面引入含羟基的凝胶层；

(4)将步骤(2)所得drug、引发剂，交联剂及乳化剂按照摩尔比6：1：1：0.5配制成质量浓度为10-30wt％的乳液体系.；在含羟基的凝胶层上，涂覆一层该乳液在30℃-70℃烘箱中反应0.5h-2h，获得加载药物的凝胶层。

3.进一步，高分子膜厚度为100μm-1mm,具有无孔或有孔的结构，孔径1-10μm，其制备方法包括：静电纺丝、熔融浇注或真空模压法。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高分子膜为聚氨酯及或硅橡胶。

5.进一步，带羧基抗炎药为非甾体类抗炎药物。

6.进一步，烯醇类单体n-羟乙基丙烯酰胺、n-羟甲基丙烯酰胺。

7.进一步，引发剂为过硫酸钾或过硫酸铵。

8.进一步，交联剂为n,n’-亚甲基双丙烯酰胺。

9.进一步，乳化剂为十二烷基磺酸钠、十二烷基磺酸钠-明胶的复配体系。

10.进一步，将步骤(1)或步骤(3)紫外光引发的波长为200-400nm,照射时长10-60min，照射距离50mm。

附图说明

图1聚氨酯表面加载药物的过程方法示意图

其中：

mba:n,n’-亚甲基双丙烯酰胺交联剂

heaa:n-羟乙基丙烯酰胺

k2s2o8:过硫酸胺引发剂

sds:十二烷基磺酸钠表面活性剂

图2是n-羟乙基丙烯酰胺(hemaa)与吲哚美辛(idcm)在dcc/dmap(n,n'-二环己基碳酰亚胺/4-二甲氨基吡啶)催化下进行酯化反应的方程式：

图3炎症响应性药物释放膜材料在没有ce的pbs的缓冲溶液和50u/mlce酶溶液中浸泡3小时后药物释放的高效液相色谱曲线

图4在ce酶中浸泡时间12h-72h后hplc谱图，可以发现连接c＝c的药物分子的浓度逐渐减少，而吲哚美辛的含量增加，可以看出，酯键对胆固醇酯酶具有很高的敏感性。

图5无脂多糖(lps)刺激(con)以及lps刺激下不同药物加载量的样品(y10，y20)与直接加药品(dm1)对炎症因子il-6分泌的影响对比

con:空白对照(不刺激，不加药)；lps:脂多糖；y10，y20：材料组(y10：载药量为10wt％；y20:载药量为20wt％)；dm：直接加入吲哚美辛药物对照组

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明，但并不局限于以下的实施例。在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，但凡在本发明的精神和原则之内，这些等价形式的改动、修改等均应包含在本发明的?；し段е?。

实施例1

(1)在静电纺丝多孔聚氨酯(pu)表面，将itx丙酮饱和溶液涂覆在聚氨酯表面，将聚氨酯表面全部覆盖后，盖上石英板，通过紫外光照射10分钟(波长200nm，照射距离50mm)，将itxsp官能团引入到聚氨酯(pu)膜表面(厚度100μm，平均孔径1μm)。

(2)通过n-羟乙基丙烯酰胺(hemaa)与吲哚美辛(idcm)在dcc/dmap(n，n′-二环己基碳酰亚胺/4-二甲氨基吡啶)催化下进行酯化反应，从而得到含药物、酯键及双键的单体。其中反应单体与引发剂的投料摩尔比为idcm∶hemaa∶dcc∶dmap＝1∶3∶3∶0.5，溶剂为无水dmf，反应温度为40℃，反应时间24h。先一次性加入除dcc以外其他原料，然后冰浴条件下加入dcc，持续冰浴约20分钟；反应结束后，冰浴冷却反应液使n，n′二环己基脲(dcu)析出，抽滤，滤液用水溶液沉淀，静置/离心至上层液澄清；倒出上层清液，下层沉淀用乙醚超声脱落，过滤得沉淀，用石油醚清洗3次；以乙酸乙酯和石油醚的混合溶液(体积比6∶1)的流动相过柱子提纯，45℃的条件下旋转获得产物。收取产物，至于冰箱中保存。通过该方法获得含c＝c的药物分子。

(3)将过硫酸胺引发剂(k2s2o8)，n，n′-亚甲基双丙烯酰胺交联剂(mba)以及n-羟乙基丙烯酰胺(heaa)按照摩尔比1∶1∶5配制成溶液，三者质量占溶液总质量的10wt％。在载有itxsp官能团的聚氨酯表面，涂覆配制的溶液，盖上石英板，通过紫外光引发(波长200nm，时长60min，照射距离50mm)，从而在该膜表面引入含羟基的凝胶层。两次紫外光引发一个有光强一个有距离建议修改为一致

(4)将步骤(2)所得产物、k252o8，mba及sds按照摩尔比6∶1∶1∶0.5配制成质量比为10wt％的乳液体系，将该乳液体系涂覆在步骤(3)获得的含羟基的凝胶层表面。在70℃烘箱中反应0.5h，在膜表面获得含药物的凝胶层，其中药物以酯键固定在凝胶层中。且药物含量为1.5μg/cm2。1小时药物释放达到总量的95％。

实施例2

(1)在静电纺丝多孔聚氨酯(pu)表面，将itx丙酮饱和溶液涂覆在聚氨酯表面，将聚氨酯表面全部覆盖后，盖上石英板，通过紫外光照射10分钟(波长400nm，照射距离50mm)，将itxsp官能团引入到聚氨酯(pu)膜表面(厚度1mm，平均孔径10μm)；

(2)通过n-羟乙基丙烯酰胺(hemaa)与吲哚美辛(idcm)在dcc/dmap(n，n′-二环己基碳酰亚胺/4-二甲氨基吡啶)催化下进行酯化反应，从而得到含药物、酯键及双键的单体。其中反应单体与引发剂的投料摩尔比为idcm∶hemaa∶dcc∶dmap＝1∶3∶3∶0.5，溶剂为无水dmf，反应温度为40℃，反应时间24h。先一次性加入除dcc以外其他原料，然后冰浴条件下加入dcc，持续冰浴约20分钟；反应结束后，冰浴冷却反应液使dcu析出，抽滤，滤液用水溶液沉淀，静置/离心至上层液澄清；倒出上层清液，下层沉淀用乙醚超声脱落，过滤得沉淀，用石油醚清洗3次；以乙酸乙酯和石油醚的混合溶液(体积比6∶1)的流动相过柱子提纯，45℃的条件下旋转获得产物。收取产物，至于冰箱中保存。该凝胶层厚度为0.1mm。

(3)将过硫酸胺引发剂(k2s2o8)，n，n′-亚甲基双丙烯酰胺交联剂(mba)以及n-羟乙基丙烯酰胺(heaa)按照摩尔比1∶1∶5配制成溶液，三者质量占溶液总质量的30wt％。在载有itxsp官能团的聚氨酯表面，涂覆配制的溶液，盖上石英板，通过紫外光引发(波长400nm，时长30min，照射距离50mm)，从而在该膜表面引入合羟基的凝胶层。

(4)将步骤(2)所得产物、k2s2o8，mba及sds按照摩尔比6∶1∶1∶0.5配制成质量比为30wt％的乳液体系，将该乳液体系涂覆在步骤(3)获得的含羟基的凝胶层表面。在30℃烘箱中反应2h，在膜表面获得含药物的凝胶层，其中药物以酯键固定在凝胶层中，且药物含量为1μg/cm²，1小时药物释放达到总量的96％。

实施例3

(1)在静电纺丝多孔聚氨酯(pu)表面，将itx丙酮饱和溶液涂覆在聚氨酯表面，将聚氨酯表面全部覆盖后，盖上石英板，通过紫外光照射10分钟(波长350nm，照射距离50mm)，将itxsp官能团引入到聚氨酯(pu)膜表面(厚度0.5mm，平均孔径6μm)；

(2)通过n-羟乙基丙烯酰胺(hemaa)与吲哚美辛(idcm)在dcc/dmap(n，n′-二环己基碳酰亚胺/4-二甲氨基吡啶)催化下进行酯化反应，从而得到含药物、酯键及双键的单体。其中反应单体与引发剂的投料摩尔比为idcm∶hemaa∶dcc∶dmap＝1∶3∶3∶0.5，溶剂为无水dmf，反应温度为40℃，反应时间24h。先一次性加入除dcc以外其他原料，然后冰浴条件下加入dcc，持续冰浴约20分钟；反应结束后，冰浴冷却反应液使dcu析出，抽滤，滤液用水溶液沉淀，静置/离心至上层液澄清；倒出上层清液，下层沉淀用乙醚超声脱落，过滤得沉淀，用石油醚清洗3次；以乙酸乙酯和石油醚的混合溶液(体积比6∶1)的流动相过柱子提纯，45℃的条件下旋转获得产物。收取产物，至于冰箱中保存。该凝胶层厚度为0.1mm。

(3)将过硫酸胺引发剂(k2s2o8)，n，n′-亚甲基双丙烯酰胺交联剂(mba)以及n-羟乙基丙烯酰胺(heaa)按照摩尔比1∶1∶5配制成溶液，三者质量占溶液总质量的20wt％。在载有itxsp官能团的聚氨酯表面，涂覆配制的溶液，盖上石英板，通过紫外光引发(波长350nm，时长45min，照射距离50mm)，从而在该膜表面引入合羟基的凝胶层。

(4)将步骤(2)所得产物、k252o8，mba及sds按照摩尔比6∶1∶1∶0.5配制成质量比为20wt％的乳液体系，将该乳液体系涂覆在步骤(3)获得的合羟基的凝胶层表面。在40℃烘箱中反应1.5h，从而将药物以酯键固定在静电纺丝型聚氨酯膜表面。在膜表面获得合药物的凝胶层，其中药物以酯键固定在凝胶层中，且药物含量为0.8μg/cm².1小时药物释放达到总量的98％。

实施例4

将实施例3中的电纺聚氨酯pu膜替换成熔融浇注法制备的无孔pu膜，其他实验条件与实施例3相同。将药物以酯键固定在静电纺丝型聚氨酯膜表面的加载药物的凝胶层中，其中药物含量为0.3μg/cm²。1小时药物释放达到总量的97％。

实施例5

将实施例1中的电纺聚氨酯pu膜替换成真空模压法制备的无孔pu膜，其他实验条件与实施例1相同。将药物以酯键固定在静电纺丝型聚氨酯膜表面加载药物的凝胶层中，其中药物含量为0.6μg/cm².1小时药物释放达到总量的98％。

实施例6

将实施例3中的电纺聚氨酯pu膜替换成熔融浇注法制备的0.5mm厚的无孔硅橡胶膜，其他实验条件与实施例3相同。将药物以酯键固定在熔融浇注法制备的无孔硅橡胶膜表面的加载药物的凝胶层中，其中药物含量为0.3μg/cm²。1小时药物释放达到总量的97％。

实施例7

将实施例1中的n-羟乙基丙烯酰胺(hemaa)替换成n-羟甲基丙烯酰胺(ham)，其他实验条件与实施例1相同。n-羟甲基丙烯酰胺(ham)与吲哚美辛(idcm)合成的产物通过质谱和核磁测试，发现在质谱图中出现分子量为440.9的物质，且对比核磁图中相应的h的化学位移，可以确定获得所需产物?；竦媒┪镆怎ゼ潭ㄔ诰驳绶乃啃途郯滨ツけ砻婧竦募釉匾┪锏哪翰阒?，其中药物含量为1.3μg/cm²。1小时药物释放达到总量的97％。

实施例8

将实施例1中的抗炎药物吲哚美辛替换成阿司匹林，其他实验条件与实施例1相同。测定阿司匹林与n-羟乙基丙烯酰胺(hemaa)反应产物的质谱图和核磁图，发现在质谱图中出现分子量为277.29的物质，且对比核磁图中相应的h的化学位移，可以确定获得所需产物?；竦媒┪镆怎ゼ潭ㄔ诰驳绶乃啃途郯滨ツけ砻婕釉匾┪锏哪翰阒?，其中药物含量为1.2μg/cm²。1小时药物释放达到总量的96％。

实施例9

将实施例1中的热引发剂过硫酸钾替换成过硫酸铵，其他实验条件与实施例1相同?；竦媒┪镆怎ゼ潭ㄔ诰驳绶乃啃途郯滨ツけ砻婕釉匾┪锏哪翰阒?，其中药物含量为1.3μg/cm²。1小时药物释放达到总量的98％。

实施例10

将实施例1中的乳化剂十二烷基磺酸钠换成十二烷基磺酸钠-明胶的复配体系，其他实验条件与实施例1相同?；竦媒┪镆怎ゼ潭ㄔ诰驳绶乃啃途郯滨ツけ砻婧竦募釉匾┪锏哪翰阒?，其中药物含量为1.5μg/cm²。1小时药物释放达到总量的94％。