包含重组重叠肽和天然蛋白质的疫苗制剂的制作方法

本发明提供了用于免疫和/或治疗受试者的包含多肽和天然蛋白质或它们的部分或者包含编码所述多肽和天然蛋白质或它们的部分的多肽的制剂、组合物和试剂盒，以及使用所述制剂、组合物和试剂盒的治疗方法，和制造所述制剂、组合物和试剂盒的方法。

背景技术：

1、当然，疫苗的效力在其有效缓解疾病的能力方面是关键的。疫苗可以是预防性的-预防疾病-或治疗性的-治疗现有疾病。在预防性疫苗的情况下，虽然希望更有效的疫苗是基本的，但是在一些情况下，疫苗有效减轻疾病的最小效力阈值是存在的。例如，在最近的研究中，示出了为了使疫苗有效地预防sars-cov-2流行，疫苗作为唯一干预的效力阈值是，它在预防感染方面必须至少有60％的有效性以使感染数的峰值降低99％(bartsch等人，2020年)。相同的研究示出，为了消灭5％的群体已经暴露于病毒的活跃流行病，疫苗效力必须为至少60％，以假设100％覆盖率时将峰值降低85％，当覆盖率降至75％时疫苗效力上升至80％，并且当覆盖率降至60％时疫苗效力上升至100％。因此，显然加强疫苗效力不仅是期望的，而且是必需的，特别是在覆盖率不可能很高的流行病早期阶段的情况下。

2、在治疗性疫苗的情况下，例如癌症免疫治疗性疫苗技术，公认的是，单个最重要的因素是抗原的选择(hollingsworth和jansen，2019年)。然而，已经尝试了其他策略来加强此类疫苗的效力。例如通过将它们与检查点抑制剂、佐剂、细胞因子、化疗剂等组合。然而，这些策略仍然具有显著的障碍，需要克服这些障碍以安全地提高效力并向临床发展。

3、需要的是一种方法，该方法改善给定疫苗的效力而不引入进一步的显著技术障碍或损害患者安全性。令人惊讶地，申请人已经发现，与天然蛋白质序列或其部分或片段同时引入重组重叠肽疫苗导致受试者的免疫应答的量级增加，从而表明疫苗方案的效力增加。申请人已经发现，这对于疫苗联合治疗方法具有广泛的普遍适用性。

技术实现思路

1、在一个方面，本发明提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的制剂，所述制剂包含：多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自天然蛋白质序列的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自所述天然蛋白质序列的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一者之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列；和所述天然蛋白质序列或其部分。

2、在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段包含一个或多个重叠序列。在一些实施方案中，所述一个或多个重叠序列的长度介于2至31个氨基酸之间，任选地其中所述一个或多个重叠序列的长度为至少8个氨基酸。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列是外源蛋白酶切割位点，任选地是组织蛋白酶切割序列，优选地是组织蛋白酶s，更优选地是lrmk切割序列。在一些实施方案中，所述多肽包含三个或更多个肽片段，优选地五个或更多个肽片段，更优选地十个或更多个肽片段。

3、在一些实施方案中，所述制剂进一步包含药学上可接受的载体。

4、在一些实施方案中，所述制剂进一步包含佐剂，优选地是单磷酸酯脂质a(mpl)、montanide、基于明矾的佐剂、水包油剂或油包水剂，更优选地是单磷酸酯脂质a、montanide或基于明矾的佐剂。

5、在一些实施方案中，所述多肽的浓度介于10μg.kg-1至10000μg.kg-1之间，并且所述天然蛋白质序列或其部分的浓度介于10μg.kg-1至10000μg.kg-1之间。

6、在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是冠状病毒的s蛋白质。在一些实施方案中，所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒，任选地是sars-cov-2。在一些实施方案中，所述冠状病毒是人冠状病毒。在一些实施方案中，所述多肽的所述两个或更多个肽片段中的至少两者包含源自s蛋白质的s1和/或s2亚基的序列，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含源自s蛋白质的s1和/或s2亚基的序列。

7、在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含源自受体结合结构域(rbd)的序列，任选地是s1亚基的受体结合基序(rbm)，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含受体结合结构域(rbd)，任选地是s1亚基的受体结合基序(rbm)。

8、在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段的至少一者包含源自s2亚基的hr2和/或hr1结构域的序列，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含s2亚基的hr2和/或hr1结构域。

9、在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是存活蛋白(survivin)，其选自下列存活蛋白同工型中的任一者：同工型1、同工型2、同工型3、同工型4、同工型5、同工型6或同工型7。在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：

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19、并且所述多肽引发免疫应答或具有免疫刺激性。

20、在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段包含与以下项具有至少90％同一性的序列

21、ptenepdlaqcffcfkelegwepdddpie和/或

22、fkelegwepdddpieehkkhssgcaflsvk，

23、并且所述多肽引发免疫应答，任选地是t细胞应答。

24、在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是人乳头瘤病毒(hpv)的e6或e7蛋白质。

25、在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是：

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31、在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：

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36、在另一方面，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含编码天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸和/或编码多肽的一种或多种多核苷酸，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自天然蛋白质序列的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自所述天然蛋白质序列的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一者之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列。

37、在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段包含一个或多个重叠序列。在一些实施方案中，所述一个或多个重叠序列的长度介于2至31个氨基酸之间，任选地其中所述一个或多个重叠序列的长度为至少8个氨基酸。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列是外源蛋白酶切割位点，任选地是组织蛋白酶切割序列，优选地是组织蛋白酶s，更优选地是lrmk切割序列。在一些实施方案中，所述多肽包含三个或更多个肽片段，优选地五个或更多个肽片段，更优选地十个或更多个肽片段。

38、在一些实施方案中，所述制剂进一步包含药学上可接受的载体。

39、在一些实施方案中，制剂进一步包含佐剂，优选地是单磷酸酯脂质a(mpl)、montanide、基于明矾的佐剂、水包油剂或油包水剂，更优选地是单磷酸酯脂质a、montanide、基于明矾的佐剂。

40、在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是冠状病毒的s蛋白质。在一些实施方案中，所述冠状病毒是β冠状病毒，任选地是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒，任选地是sars-cov-2。在一些实施方案中，所述冠状病毒是人冠状病毒。在一些实施方案中，所述多肽的所述两个或更多个肽片段中的至少两者包含源自s蛋白质的s1和/或s2亚基的序列，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含源自s蛋白质的s1和/或s2亚基的序列。

41、在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含源自受体结合结构域(rbd)的序列，任选地是s1亚基的受体结合基序(rbm)，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含受体结合结构域(rbd)，任选地是s1亚基的受体结合基序(rbm)。

42、在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段的至少一者包含源自s2亚基的hr2和/或hr1结构域的序列，并且/或者其中所述天然蛋白质序列的所述部分包含s2亚基的hr2和/或hr1结构域。

43、在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是存活蛋白，其选自下列存活蛋白同工型中的任一者：同工型1、同工型2、同工型3、同工型4、同工型5、同工型6或同工型7。在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：

44、mgaptlppawqpflkdhristfknwpfleg、

45、dhristfknwpflegcactpermaeagfih、

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53、并且所述多肽引发免疫应答或具有免疫刺激性。

54、在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段包含与以下项具有至少90％同一性的序列

55、ptenepdlaqcffcfkelegwepdddpie和/或

56、fkelegwepdddpieehkkhssgcaflsvk，

57、并且所述多肽引发免疫应答，任选地是t细胞应答。

58、在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是人乳头瘤病毒(hpv)的e6或e7蛋白质。

59、在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列是：

60、mhqkrtamfq?dpqerprklp?qlctelqtti?hdiilecvyc?kqqllrrevy

61、dfafrdlciv?yrdgnpyavc?dkclkfyski?seyrhycysl?ygttleqqyn

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64、hynivtfcck?cdstlrlcvq?sthvdirtle?dllmgtlgiv?cpicsqkp。

65、在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一者包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：

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70、在本发明的另一方面，提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用根据前述方面中任一项所述的制剂。

71、本发明的另一方面提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的组合物，其中所述组合物包含根据前述方面所述的制剂，并且其中所述多肽与所述天然蛋白质序列或其部分，或编码所述天然蛋白质序列或其部分和/或所述多肽的一种或多种多核苷酸共同施用。

72、本发明的另一方面提供了一种制备疫苗的方法，所述方法包括在体外的一个或多个细胞中表达编码根据任一前述方面所述的天然蛋白质序列或其部分和多肽的一种或多种多核苷酸，以及纯化所述天然蛋白质序列或其部分和多肽。在一些实施方案中，将所纯化的天然蛋白质序列或其部分和多肽组合成单一制剂。

73、一种用于免疫和/或治疗受试者的试剂盒，所述试剂盒包含根据上述方面中的任一项所述的天然蛋白质序列或其部分、或编码天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸、和根据上述方面所述的多肽，或编码多肽的一种或多种多核苷酸。

74、本发明的另一方面提供了一种用于免疫和/或治疗受试者的方法，所述方法包括：施用根据前述方面所述的天然蛋白质序列或其部分，或编码所述天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸，以及施用根据前述方面所述的多肽，或编码所述多肽的一种或多种多核苷酸。

75、在一些实施方案中，所述天然蛋白质序列或其部分，或编码所述天然蛋白质序列或其部分的一种或多种多核苷酸与所述多肽或编码所述多肽的一种或多种多核苷酸同时、依次或分开施用。