高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位疫苗筛选及应用

本发明属于动物疫苗与兽用生物制品，具体涉及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位疫苗筛选及应用。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome,prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine?reproductive?and?respiratory?syndromevirus,prrsv)引起的一种严重的猪转染病，在我国于1996年分离出病毒，从而证实了该病在我国的存在。被prrsv感染的妊娠母猪主要表现为繁殖障碍，如早产，流产，妊娠后期出现死胎、木乃伊胎等；断奶仔猪感染后表现为呼吸窘迫，关节炎、下痢等临床症状。prrs严重制约了我国养猪业的可持续发展，给我国生猪养殖业带来了不可估量的损失。

2、prrsv属于动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，是一种有囊膜的单股正链小rna病毒，基因组全长约15,000bp，共有11个开放阅读框。prrsv?pp1a经过9次蛋白酶的切割，被加工成10种病毒非结构蛋白，nsp1α通过其羧基末端扩展区域来抑制ifn-β的产生；nsp1β在prrsv的增殖和免疫逃避中起着重要作用，他不仅可以通过与ploy(c)结合蛋白2相互作用来促进自身复制，还可以抑制i型干扰素和tnf-α的产生。nsp2是prrsv中分子量最大、最易突变的非结构蛋白，具有结构域、高变区、跨膜区和羧基端尾巴四个区域，具有木瓜蛋白酶样蛋白酶2活性，可拮抗i型干扰素；nsp3和nsp5是两种跨膜蛋白，参与膜重排。nsp4具有蛋白酶活性，可抑制先天性免疫反应。nsp6分子量极小，目前其在病毒感染过程中的作用尚不清楚。nsp7在病毒蛋白酶的作用下被切割成nsp7α和nsp7β，nsp7α可以与nsp9相互作用。nsp8具有nsp9的n端结构域。nsp9序列高度保守，其c端具有rna依赖性rna聚合酶结构，对病毒的致病性起到关键作用，还包含t细胞识别表位，这有利于未来疫苗的开发。nsp10是prrsv的第一个晶体结构，该晶体结构包含多个结构域：n端锌结合结构域、1b结构域和螺旋酶核心结构域，其c端独特的结构，呈现出一种新的开放状态，在螺旋酶活性中起着关键作用。nsp11具有内切核糖核酸酶活性，可抑制i型干扰素的产生；nsp12的功能也尚不明确。

3、orf2a编码gp2a，在病毒吸附过程有至关重要的作用。orf3编码gp3，在prrsv感染过程中诱导产生中和抗体。orf4编码gp4，其中和表位为59～67位氨基酸。由orf5编码的gp5具有良好的抗原性，是产生中和抗体的主要抗原，因此近年来，gp5一直作为疫苗开发的主要蛋白。orf6编码的m蛋白能够与gp5在内质网中形成gp5-m的异二聚体，从而侵入到病毒颗粒中，使其发生二硫键断，参与prrsv的组装和出芽，并且具有良好的免疫原性。

4、目前已经证实，prrs的灭活疫苗安全性和有效性存在一定缺陷，减毒活疫苗虽然可以提供较好的同源?；?，但存在毒力返强、重组、高变异性等诸多安全问题。prrs的亚单位疫苗研究尚处在探索阶段，现有技术中，cn?113563431?b成功构建了2株可溶性表达prrsv?gp5和m蛋白基因的重组杆状病毒bmp541与fmp542，为prrsv亚单位疫苗的研制奠定了基础。cn?109385435?b将人工合成的gp5与m串联序列gp5m连接到pbac5质粒骨架上，以获得的重组杆状病毒ac-prrsvgp5m所表达的蛋白制备亚单位疫苗，具有良好的疫苗前景。但是，由于prrsv复杂的免疫抑制机制，且目前大多数prrs的亚单位疫苗是基于gp5和m蛋白开发的，并不能提供完全的?；ぷ饔?。因此，探究和开发更安全、有效的prrs亚单位疫苗成为防控prrs的关键措施。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位疫苗筛选及应用，为prrsv疫苗的研发提供有效的免疫原，丰富prrsv免疫原种类，从而更好的提高对猪繁殖与呼吸综合征病毒侵染动物的?；ぢ?。

2、为实现上述目的，本发明主要包括以下内容：

3、本发明第一方面，提供了一种预防prrs的蛋白质组合物，所述蛋白质组合物包括：tgp2、tgp3、tgp4、tgp5、tm、nsp1αmt、nsp1βmt、nsp2mt、nsp4mt、nsp7α、nsp7β、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11mt、nsp12中的至少一种，其氨基酸序列分别如seq?id?no:1-seq?id?no:16所示。

4、所述蛋白质组合物为：将tgp2、tgp3、tgp4、tgp5和tm与nsp1αmt、nsp1βmt、nsp2mt、nsp4mt、nsp7α、nsp7β、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11mt、nsp12中的任意一种或两种进行组合。

5、所述蛋白质组合物为：tgp2、tgp3、tgp4、tgp5、tm、nsp4mt和nsp11mt的组合。

6、所述tgp2、tgp3、tgp4、tgp5、tm、nsp1αmt、nsp1βmt、nsp2mt、nsp4mt、nsp11mt分别是由蛋白质gp2、gp3、gp4、gp5、m、nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp4、nsp11突变或缺失得到。

7、gp2、gp3、gp4、gp5和m蛋白全长在原核里无法实现表达，通过截短去掉其信号肽或者疏水性强的区域可实现表达。nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp4、nsp11含有抑制先天性免疫反应的位点，将这些抑制先天性免疫反应的位点进行突变，可去掉其抑制功能。nsp7α、nsp7β、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11mt、nsp12这些蛋白在原核中容易表达，同时不含有抑制免疫反应的位点，因此不再对其进行突变或截短处理。

8、具体的，所述tgp2(56～205位氨基酸)为prrsv结构蛋白gp2的截短蛋白，即去除了跨膜区的gp2蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

9、所述tgp3(22～255位氨基酸)为prrsv结构蛋白gp3的截短蛋白，即去除了跨膜区的gp3蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

10、所述tgp4(31～145位氨基酸)为prrsv结构蛋白gp4的截短蛋白，即去除了跨膜区的gp4蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:3所示。

11、所述tgp5(127～200位氨基酸)为prrsv结构蛋白gp5的截短蛋白，即去除了跨膜区的gp5蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:4所示。

12、所述tm(96～175位氨基酸)为prrsv结构蛋白m的截短蛋白，即去除了跨膜区的m蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:5所示。

13、所述nsp1αmt为prrsv非结构蛋白nsp1α的176位氨基酸由苯丙氨酸突变为丙氨酸，其氨基酸序列如seq?id?no:6所示。

14、所述nsp1βmt为prrsv非结构蛋白nsp1β的突变蛋白的124位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸，128位氨基酸由精氨酸突变为丙氨酸，其氨基酸序列如seq?id?no:7所示。

15、所述nsp2mt为prrsv非结构蛋白nsp2去除跨膜区并缺失54(半胱氨酸)～123(组氨酸)位氨基酸，其氨基酸序列如seq?id?no:8所示。

16、所述nsp4mt为prrsv非结构蛋白nsp4的39位氨基酸由组氨酸突变为丙氨酸，64位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸，118位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，其氨基酸序列如seq?id?no:9所示。

17、所述nsp7α为prrsv非结构蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:10所示。

18、所述nsp7β为prrsv非结构蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:11所示。

19、所述nsp8为prrsv非结构蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:12所示。

20、所述nsp9为prrsv非结构蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:13所示。

21、所述nsp10为prrsv非结构蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:14所示。

22、所述nsp11mt为prrsv非结构蛋白nsp11的129位和144位氨基酸由组氨酸突变为丙氨酸，173位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸，其氨基酸序列如seq?id?no:15所示。

23、所述nsp12为prrsv非结构蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no:16所示。

24、本发明第二方面，提供了上述蛋白质组合物在制备预防或者治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。

25、所述疫苗为亚单位疫苗。

26、本发明第三方面，提供了一种防治猪繁殖与呼吸综合征的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗以上述的蛋白质组合物作为免疫原或者活性成分。

27、所述亚单位疫苗还包括佐剂。

28、所述佐剂为植物佐剂、细菌佐剂、铝佐剂、其他无机成分佐剂、乳剂佐剂中的一种或几种。

29、本发明第四方面，提供了上述的蛋白质组合物在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒流行病学调查产品中的应用。

30、本发明的有益效果：

31、本发明提供了预防prrs的蛋白质组合物，并从中筛选出了最佳组合，基于蛋白质组合物开发亚单位疫苗，能够克服现有技术中大多数prrs的亚单位疫苗基于gp5和m蛋白开发，不能为prrsv疫苗的研发提供有效免疫原的弊端，丰富prrsv的免疫原种类，从而更好的提高对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒侵染动物的?；ぢ?，为prrsv亚单位疫苗的研制奠定了重要基础。

32、使用该发明的蛋白质组合物制备的亚单位疫苗免疫新西兰大白兔和仔猪后获得的高水平特异性抗体，可以有效中和体外的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，实现对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒侵染动物的有效?；?，将本发明提供的预防prrs的蛋白质组合物，用于亚单位疫苗的研制，具有良好的疫苗前景。