猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株及其制备方法和应用

本发明属于生物医学，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株及其制备方法和应用。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征(prrsv)自上世纪80年代从美国爆发以来，迅速席卷全球，90年代传染至我国，对养猪行业造成了重大的经济损失；并且至今为止，对其致病机制以及毒力的研究依然不是十分透彻，从而导致目前临床上使用的弱毒疫苗和灭活疫苗对此传染病的防控效果并不理想，疫情呈周期性反复爆发。

2、目前临床上，prrsv感染耐受猪存在长期病毒血症的现象，免疫系统难以有效的清除prrsv，导致病毒不断从细胞释放出来，通常造成猪体的隐性感染，并不断向外排毒从而成为新的传染源并感染其他猪。但其中的致病机制目前研究的并不十分清楚。

技术实现思路

1、已有研究对prrsv非结构蛋白nsp4的蛋白晶体结构进行了解析，这为研究nsp4的功能打下坚实的基础。另外，研究表明prrsv非结构蛋白nsp4的domain?iii结构域能够抑制β2m的合成，从而降低了mhc-1分子在细胞表面的表达。

2、本发明的目的是，提供一种新型猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株及其制备方法和应用。该新型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株通过对prrsv非结构蛋白nsp4位点突变，显著降低prrsv的毒力，同时提高细胞免疫水平及诱导中和抗体水平。

3、本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

4、本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株，所述弱毒株是将猪繁殖与呼吸综合征病毒prrsv的非结构蛋白nsp4进行突变获得的，所述nsp4蛋白的氨基酸序列与seqid?no：2～7中任意一种具有至少95％、或至少98％、或至少99％的序列一致性，所述突变是在seq?id?no：2～7中任意一种所示氨基酸序列的第76位、第111位、第115位、第155位、第173位、第186位进行单位点突变或多位点突变；所述突变方式为下列之一：

5、(1)第76位突变为丙氨酸a、天冬酰胺n、异亮氨酸i、精氨酸r、甘氨酸g、缬氨酸v或色氨酸w；

6、(2)第111位突变为丙氨酸a；

7、(3)第115位突变为丝氨酸s；

8、(4)第155位突变为苏氨酸t、异亮氨酸i、精氨酸r、丙氨酸a、赖氨酸k、甘氨酸g或天冬氨酸d；

9、(5)第173位突变为苏氨酸t、精氨酸r、甘氨酸g或丙氨酸a；

10、(6)第186位突变为丙氨酸a、苏氨酸t、缬氨酸v、精氨酸r、天冬氨酸d或甘氨酸g。

11、作为优选实施方式，所述突变方式为下列之一：

12、(1)seq?id?no：2所示的氨基酸序列第155位的苏氨酸t突变为异亮氨酸i、精氨酸r、丙氨酸a、赖氨酸k或甘氨酸g；

13、(2)seq?id?no：3所示的氨基酸序列第155位的丙氨酸a突变为苏氨酸t、异亮氨酸i、精氨酸r、赖氨酸k或甘氨酸g；

14、(3)seq?id?no：4所示的氨基酸序列第155位的赖氨酸k突变为苏氨酸t、异亮氨酸i、精氨酸r、丙氨酸a或天冬氨酸d；

15、(4)seq?id?no：5所示的氨基酸序列第155位的丙氨酸a突变为苏氨酸t、赖氨酸k、甘氨酸g或天冬氨酸d；

16、(5)seq?id?no：6所示的氨基酸序列第155位的苏氨酸t突变为丙氨酸a、异亮氨酸i、精氨酸r、赖氨酸k或甘氨酸g；

17、(6)seq?id?no：7所示的氨基酸序列第155位的丙氨酸a突变为苏氨酸t、异亮氨酸i、精氨酸r、赖氨酸k、甘氨酸g或天冬氨酸d；

18、(7)seq?id?no：2或seq?id?no：3所示的氨基酸序列第76位的丙氨酸a突变为缬氨酸v、异亮氨酸i、精氨酸r、甘氨酸g或色氨酸w；

19、(8)seq?id?no：4或seq?id?no：5所示的氨基酸序列第76位的缬氨酸v突变为丙氨酸a、天冬酰胺n、异亮氨酸i、精氨酸r、甘氨酸g或色氨酸w；

20、(9)seq?id?no：6所示的氨基酸序列第76位的缬氨酸v突变为丙氨酸a、异亮氨酸i、精氨酸r或天冬酰胺n；

21、(10)seq?id?no：7所示的氨基酸序列第76位的丙氨酸a突变为苏氨酸t、精氨酸r、甘氨酸g、缬氨酸v或色氨酸w；

22、(11)seq?id?no：2或seq?id?no：3所示的氨基酸序列第173位的亮氨酸l突变为苏氨酸t、精氨酸r或甘氨酸g；

23、(12)seq?id?no：4或seq?id?no：5所示的氨基酸序列第173位的亮氨酸l突变为丙氨酸a、苏氨酸t、精氨酸r或甘氨酸g；

24、(13)seq?id?no：6或seq?id?no：7所示的氨基酸序列第173位的亮氨酸l突变为丙氨酸a、苏氨酸t或精氨酸r；

25、(14)seq?id?no：2或seq?id?no：3所示的氨基酸序列第186位的异亮氨酸i突变为苏氨酸t、丙氨酸a、精氨酸r、天冬氨酸d或缬氨酸v；

26、(15)seq?id?no：4所示的氨基酸序列第186位的苏氨酸t突变为精氨酸r或天冬氨酸d；

27、(16)seq?id?no：5所示的氨基酸序列第186位的缬氨酸v突变为精氨酸r或天冬氨酸d；

28、(17)seq?id?no：6所示的氨基酸序列第186位的苏氨酸t突变为丙氨酸a、缬氨酸v、天冬氨酸d或甘氨酸g；

29、(18)seq?id?no：7所示的氨基酸序列第186位的异亮氨酸i突变为丙氨酸a、精氨酸r、天冬氨酸d或甘氨酸g；

30、(19)seq?id?no：2～7其中任意一种所示的氨基酸序列第111位的半胱氨酸c突变为丙氨酸a；

31、(20)seq?id?no：2～7其中任意一种所示的氨基酸序列第115位的半胱氨酸c突变为丝氨酸s。

32、作为优选实施方式，对于seq?id?no：2所示的氨基酸序列，其多位点突变方式为下列之一：

33、所述多位点突变的突变方式为下列之一：t155a+a76v、t155k+a76v、t155g+a76v+l173a、l173a+a76g、l173t+i186a、l173r+i186r、t155i+a76r+l173a、t155i+a76r+i186a、i186v+c111a+l173a、i186t+c111a+l173d或t155i+a76r+c111a+l173a。

34、作为优选实施方式，对于seq?id?no：3所示的氨基酸序列，其多位点突变方式为下列之一：a155t+a76v、a155i+c111a+l173a、a155r+c111a+l173a、a155k+a76v、a155g+l173t+i186a、l173a+a76g、a155g+a76v、l173t+i186a、l173r+i186r、a155k+a76r+i186d、a155k+a76r+i186r、i186v+c111a+l173a、i186t+c111a+l173d或a155k+a76r+c111a+l173a。

35、作为优选实施方式，对于seq?id?no：4所示的氨基酸序列，其多位点突变方式为下列之一：k155d+v76g+c111a、k155i+v76a+l173a、k155r+v76r、k155a+v76a、k155t+v76a、v76i+c111a、v76r+c115s、l173t+t186d、l173r+t186d、l173g+t186d、l173a+c111a、k155i+v76r+c111a或k155i+v76r+c111a+l173a。

36、作为优选实施方式，对于seq?id?no：5所示的氨基酸序列，其多位点突变方式为下列之一：a155t+v76a、a155t+v76g+c111a、a155k+v76a、a155k+v76r+l173a、a155g+v76g、v76i+c111a、v76r+c115s、l173a+c111a、a155k+v76r+c111a或a155k+v76r+c111a+l173a。

37、作为优选实施方式，对于seq?id?no：6所示的氨基酸序列，其多位点突变方式为下列之一：t155i+v76a、t155r+v76r、t155k+v76a、t155g+v76r+c111a、v76a+l173t、v76r+l173a+c111a、l173a+c111a、l173a+c111a+t186g、t186d+t155i、t186v+l173t或t155i+v76r+c111a+l173a。

38、作为优选实施方式，对于seq?id?no：7所示的氨基酸序列，其多位点突变方式为下列之一：a155t+a76v、a155k+a76t、a155g+a76v+c111a、a76w+c115s、a76w+l173t、a76r+l173a+c111a、l173a+c111a、i186d+a155i、i186r+c115s或a155k+a76r+c111a+l173a。

39、本发明还提供一种所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株的制备方法，所述方法包括以下步骤：

40、1)根据酶切位点将prrsv全基因组分为四个片段，设计引物对四个目的片段进行pcr扩增；

41、2)将步骤1)中扩增后的片段通过不同的酶切位点插入到质粒上，构建成包含猪繁殖与呼吸综合征病毒野生毒株全基因组的质粒；

42、3)根据权利要求1-8任一项所述的突变方式，对步骤2)构建后的质粒进行单位点突变或多位点突变，获得包含prrsv突变基因的质粒，将质粒转入到表达载体中进行表达获得弱毒株。

43、作为优选实施方式，所述步骤3)中的表达载体为pk15或marc-145细胞上进行转染。

44、本发明还提供一种所述的弱毒株在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用。

45、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

46、1.本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株促进β2m分子的表达，促进sla-1分子的表达，不仅能够诱导更好的细胞免疫，而且能够使其毒力进一步降至到更低的水平。

47、2.本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株显著提升诱导和抗体水平的能力；并且解决临床上猪只隐性带毒并排毒的问题。

48、3.目前对于prrsv非结构蛋白nsp4位点突变获得的重组病毒，毒价低，病毒复制能力显著降低，并不具有疫苗生产潜力；本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株毒价高，病毒复制能力不受影响；毒力降低，并在猪上得以验证，具有疫苗生产潜力。