一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用TD-PCR反应试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测，具体涉及一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒。

背景技术：

1、自21世纪以来，抗生素耐药已成为全球各个国家面临的医疗难题，并被世界卫生组织列为21世纪人类面临的主要公共卫生威胁之一。

2、随着细菌抗生素耐药问题日趋严峻，监测和了解抗生素耐药性的流行、机制和传播规律是感染控制战略的优先事项。细菌耐药基因(args)的快速和准确的检测，可提高临床上应对细菌耐药事件的能力。目前全基因组测序分析(whole?genome?sequencing，wgs)是一种快速且准确的args检测方法，但对于大批量样品的长期检测，该方案与聚合酶链反应(pcr)技术相比，检测成本控制较高。pcr方法检测args仍是应用较为广泛的一种方法，通常，针对一株临床分离菌株，根据检测需求，需要检测数十种不同类args，然而，因每一种arg对应的引物退火温度不同，得分多次进行pcr反应，因此，一方面多次扩增将导致检测时效性差，另一方面造成pcr扩增仪的样品孔使用率不高，除此之外，部分args?pcr反应非特异性扩增较多，对结果的判断造成干扰。

3、针对上述问题，亟需建立一种通用、特异性强且可覆盖大部分args扩增的pcr反应程序。本发明开发了一种适用于大肠杆菌29种args检测的td-pcr反应试剂盒，从退火温度、扩增产物长度、引物碱基数、扩增产物量方面进行分析，通过分析该反应试剂盒在24株鹅源分离的大肠杆菌中29种args的检测结果，并与普通pcr反应试剂盒作比较，为细菌耐药性的研究提供便捷高效的技术手段。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒，以解决现有技术中同时检测多种args时，需分多次进行pcr反应，导致检测时效性差，且易造成pcr扩增仪的样品孔使用率不高，以及因部分args的pcr反应非特异性扩增较多，对结果的判断造成干扰的问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、一种大肠杆菌部分耐药基因检测的通用td-pcr反应试剂盒，包含pcr试验通用引物和细菌耐药基因引物，所述试剂盒的td-pcr扩增反应程序包括以下5个阶段：

4、第一阶段的反应参数为：95℃预变性5min；

5、第二阶段的反应参数为：95℃变性10s、55℃退火30s、72℃延伸60s；

6、第三阶段的反应参数为：95℃变性10s、54℃退火30s、72℃延伸60s；

7、第四阶段的反应参数为：95℃变性10s、52℃退火30s、72℃延伸60s；

8、第五阶段的反应参数为：72℃延伸5min。

9、进一步，所述第二阶段共5个循环。

10、进一步，所述第三阶段共5个循环。

11、进一步，所述第四阶段共20个循环。

12、进一步，所述pcr试验通用引物是以大肠杆菌标准菌株k12?mg1655?yeej基因为模板设计合成不同tm值、不同产物长度、不同长度的引物，所述细菌耐药基因引物包括β-内酰胺酶类耐药基因引物、氨基糖苷类耐药基因引物、酰胺醇类耐药基因引物、喹诺酮类耐药基因引物和黏菌素类耐药基因引物。

13、进一步，所述β-内酰胺酶类耐药基因引物包括：

14、bladha：f：5'-aactttcacaggtgtgctgt-3’；

15、blacmy-2：f：5'-atgatgaaaaaatcgttatgc-3’；

16、blatem：f：5'-ataaaattcttgaagacgaaa-3’；

17、blashv：f：5'-cactcaaggatgtattgtg-3’；

18、blactx-m-1g：f：5'-cttccagaataaggaatccc-3’；

19、blactx-m-9g：f：5'-tgaccgtattgggagtttg-3’；

20、blaoxa：f：5'-atatctctactgttgcatctcc-3’。

21、进一步，所述氨基糖苷类耐药基因引物包括：

22、aac(3’)-ia：f：5'-ttacgcagcagcaacgatgt-3’；

23、aac(3’)-ⅱc：f：5'-aaccggtgacctattgatgg-3’；

24、aac(3’)-ⅳ：f：5'-ggccacttggactgatcgag-3’；

25、aac(6’)-ib：f：5'-ttgcgatgctctatgagtggcta-3’；

26、aada1：f：5'-aggtagttggcgtcatcgag-3’；

27、aada2：f：5'-ggtgctaagcgtcattgagc-3’；

28、rmta：f：5'-ctagcgtccatcctttcctc-3’；

29、rmtb：f：5'-acatcaacgatgccctcac-3’。

30、进一步，所述酰胺醇类耐药基因引物包括：

31、cat1：f：5'-cttgtcgccttgcgtataat-3’；

32、cat2：f：5'-aacggcaygatgaacctgaa-3’；

33、cmla：f：5'-cgccacggtgttgttgttat-3’；

34、cmlb：f：5'-actcggcatggacatgtact-3’；

35、for：f：5'-ctgagggtgtcgtcatctac-3’。

36、进一步，所述喹诺酮类耐药基因引物包括：

37、qnra：f：5'-atttctcacgccaggatttg-3’；

38、qnrb：f：5'-gatcgtgaaagccagaaagg-3’；

39、qnrc：f：5'-atttctcacaggcaaact-3’；

40、qnrd：f：5'-ttttcgctaactaactcgc-3’；

41、qnrs：f：5'-acgacattcgtcaactgcaa-3’；

42、qepa：f：5'-gcaggtccagcagcgggtag-3’；

43、oqxa：f：5'-gatcagtcag?tgggatagttt-3’

44、oqxb：f：5'-ttctcccccggcgggaagtac-3’。

45、进一步，所述黏菌素类耐药基因引物包括：

46、mcr-1：f：5'-cggtcagtccgtttgttc-3’。

47、综上所述，本发明具有以下有益效果：

48、退火的温度关系到pcr反应的特异性好坏，本发明通过将反应程序分为5个阶段，并设置了3个由高到低的退火温度及对应循环数，使得pcr反应在较高温条件下特异性更好，随着退火温度的逐渐过渡降低，使得pcr反应在较低温度条件下敏感性更好；使得本发明td-pcr反应程序可以有效应用于大肠杆菌29种耐药基因的检测，且特异性优于普通pcr反应程序。