一种降解异质性微凝胶组装体支架及其制备方法

本发明属于生物医用材料和组织工程领域，具体涉及一种降解异质性微凝胶组装体支架及其制备方法。

背景技术：

1、细胞迁移、细胞凝聚和特异性分化是组织发育和再生的关键过程，在这个过程中细胞迁移和促进细胞向特异性表型分化可通过药物进行调控，而细胞凝聚除了需要进行药物诱导，还需要足够的凝集空间。智能药物控释材料，可针对组织再生修复过程中出现的ph、温度、ros和酶的一系列病理特征变化产生响应，进而改变药物释放的速度，使得不同药物在组织修复的特定阶段能够保持最佳浓度，以精准地调控细胞迁移、细胞凝聚和细胞分化过程。大孔支架材料具有联通微孔结构，可方便细胞浸润、生长以及物质传输，可为细胞凝聚提供充足地空间。因此，如何通过分子结构设计和微观孔结构设计构建具有智能药物控释功能和联通微孔结构的材料体系，对于实现组织再生修复至关重要。

2、水凝胶由于其高含水量、良好的粘弹性和生物相容性被广泛使用，但由于其为纳米孔结构，难以为细胞聚集提供足够的空间。微凝胶作为一种微米级别的水凝胶颗粒，能够通过对其结构单元进行不同的设计从而赋予其特定的功能。具有不同性质的微凝胶可通过化学反应或物理反应，以bottom-up方式组装形成宏观异质性支架。酰胺键等稳定共价键形成的凝胶网络，不受ph、温度、ros等病理微环境影响，可长时间维持较为稳定的状态，降解缓慢；而酰腙键等动态共价键则可以对ph、温度和酶等生理环境变化产生响应，实现动态键合/断裂。合理利用稳定共价键和动态共价键调控微凝胶的交联网络结构，进而调节微凝胶的降解性能，将不同降解性能的微凝胶以bottom-up方式组装形成异质性支架，有望构建出具有智能药物控释功能和联通微孔结构的材料体系，推动组织再生修复材料的发展。

3、为了实现智能药物控释功能和联通微孔结构设计，需要设计研发新的降解异质性支架来进行改进。该支架可通过降解异质性特点实现药物的智能控释，且降解差异形成的空间能够让支架为细胞提供聚集的空间。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种降解异质性微凝胶组装体支架及其制备方法，该支架利用了席夫碱反应和酰胺化反应的特点制备出了降解速度不同的微凝胶，同时利用硫醇-烯点击反应将两种微凝胶组装形成降解异质性支架。

2、本技术提供的一种降解异质性微凝胶组装体支架的制备方法，包括以下步骤：

3、1)用材料a和材料b通过形成席夫碱键交联制备快速降解微凝胶，其中所述材料a为降冰片烯改性和氧化改性的双改性聚合物，所述材料b为己二酸己二酰肼改性的聚合物；

4、2)用材料d和材料e加入酰肼交联剂，通过形成酰胺键交联制备慢速降解微凝胶，其中材料d为降冰片烯改性的含羧基聚合物；材料e为含羧基的聚合物；

5、3)将上述两种微凝胶混合后，加入含有光引发剂的材料g的pbs溶液，混合均匀后进行紫外光照，得到微凝胶组装体支架；所述材料g为半胱氨酸盐酸盐改性的聚合物；

6、其中，所述快速降解微凝胶的制备方法为：

7、a1.将材料a和材料b分别溶解于pbs缓冲溶液中，混合搅拌均匀，用碱液调节材料a溶液的ph值，使得材料a和材料b混合之后无法成胶，将调节好ph的材料a和材料b的水溶液混合均匀得到混合溶液c，作为分散相1；在某些实施方式中，所述材料a溶液的ph值调节为9-10；

8、a2.用石油醚将乳化剂1稀释，并且加入醋酸混合均匀得到连续相1；

9、a3.将分散相1加入到连续相1后涡旋形成微液滴1，涡旋后将离心管放置在冰中，等待微液滴内部交联形成微凝胶；

10、a4.待步骤a3中的微液滴1成胶之后，加入不含乳化剂的石油醚破乳，等待石油醚自然挥发，用pbs溶液洗涤，离心得到微凝胶1，即快速降解微凝胶。

11、所述慢速降解微凝胶的制备方法为：

12、b1：将材料d和材料e一起溶解于pbs缓冲溶液中，混合搅拌均匀得到混合溶液f，在混合溶液f中加入交联剂和催化剂，搅拌均匀作为分散相2；

13、b2：用氟化油将含有乳化剂2的氟化油稀释，作为连续相2；

14、b3：将分散相2加入到连续相2后涡旋形成微液滴2，涡旋后将离心管放置在37℃水浴锅中，等待微液滴内部交联形成微凝胶；

15、b4.待步骤b3中的微液滴2成胶后，加入不含乳化剂的氟化油破乳，等待氟化油自然挥发后，用pbs溶液洗涤，离心得到微凝胶2，即慢速降解微凝胶。

16、在某些实施方式中，所述交联剂为酰肼交联剂；优选地为己二酸己二酰肼。

17、在某些实施方式中，所述材料a、材料b、材料d、材料e和材料g中的聚合物材料选自生物医用高分子，优选地，为透明质酸和明胶中的至少一种；

18、在某些实施方式中，步骤a1中所述的材料a和材料b在分散相中的浓度分别为2-4wt％、1.5-3.5wt％；步骤b1中材料d和材料e在分散相中的浓度分别为3-4wt％、6-8wt％；

19、在某些实施方式中，步骤a1所述的混合溶液c即分散相1为材料a和材料b的水溶液按1:1的比例混合得到；

20、在某些实施方式中，步骤a1所述的材料a的制备包括如下步骤：

21、向浓度为0.6-0.7wt％的分子量为100kda的聚合物材料水溶液中加入dowex50w质子交换树脂(聚合物材料与dowex?50w质子交换树脂的质量比为1:3)，搅拌5小时，将树脂过滤，滤液用tba-oh滴定至ph为中性，得到的滤液进行冷冻干燥，得到tba修饰的聚合物材料；将冷冻干燥后的tba修饰聚合物材料以1wt％的浓度溶解于无水dmso中，在氮气分为下依次加入5-降冰片烯-2-羧酸(内异构体和外异构体的混合物)、4-二甲氨基吡啶，其中5-降冰片烯-2-羧酸与tba修饰聚合物材料的摩尔比例为2.5:1-3.5:1，4-二甲氨基吡啶与tba修饰聚合物材料的摩尔比为1:1-2:1，随后将溶液温度升至45℃，用注射器将二叔丁基碳酸二酯以0.3:1-0.5:1的摩尔比例加入烧瓶中，在氮气氛围下搅拌15-25个小时后，加入冷水熄灭反应后，反应液经过透析后冻干，得到降冰片烯改性的聚合物材料；

22、将降冰片烯修饰的聚合物材料以0.15-0.4wt％的浓度溶解于去离子水中，加入与其等质量的高碘酸钠，搅拌反应四个小时，随后加入乙二醇终止反应1个小时，将反应液透析后冻干，得到降冰片烯改性和氧化改性的聚合物。

23、在某些实施方式中，步骤b1所述的材料d的制备包括如下步骤：

24、将向浓度为1.5-2.5wt％的分子量为10kda的聚合物材料水溶液中加入dowex?50w质子交换树脂(聚合物材料与dowex?50w质子交换树脂的质量比为1:3)，搅拌5小时，将树脂过滤，滤液用tba-oh滴定至ph为中性，得到的滤液进行冷冻干燥，得到tba修饰的聚合物材料；将冷冻干燥后的tba修饰聚合物材料以1wt％的浓度溶解于无水dmso中，在氮气氛围下依次加入5-降冰片烯-2-羧酸(内异构体和外异构体的混合物)、4-二甲氨基吡啶，其中5-降冰片烯-2-羧酸与tba修饰聚合物材料的摩尔比例为2.5:1-3.5:1，4-二甲氨基吡啶与tba修饰聚合物材料的摩尔比为1:1-2:1，随后将溶液温度升至45℃，用注射器将二叔丁基碳酸二酯以0.3:1-0.5:1的摩尔比例加入烧瓶中，在氮气氛围下搅拌15-25个小时后，加入冷水熄灭反应后，反应液经过透析后冻干，得到降冰片烯修饰的聚合物。

25、在某些实施方式中，步骤a1所述的材料b的制备包括如下步骤：

26、将聚合物材料和己二酸己二酰肼溶解于去离子水，分两次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)作为催化剂，在反应期间用1摩尔每升的盐酸溶液调节反应液ph值为酸性，室温搅拌反应2-4小时后将反应进行透析后冻干，得到己二酸己二酰肼改性的聚合物材料。

27、在某些实施方式中，步骤b1所述的混合溶液f中的交联剂和催化剂分别为己二酸己二酰肼和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐；所述交联剂和催化剂的比例分别为0.3-0.4wt％、6-8wt％；

28、在某些实施方式中，步骤a2所述乳化1为司班系列乳化剂，；所述乳化剂1在石油醚中的浓度4-6wt％，所述醋酸在连续相中的体积浓度为0.017-0.027％；

29、在某些实施方式中，步骤b2所述乳化剂2为2wt％fluo-surf的氟化油hfe7500溶液；所述乳化剂2用氟化油将乳化剂稀释十倍。

30、在某些实施方式中，步骤所述的分散相1和流动相1的比例为1:10，所述涡旋时间为0.5-1分钟；所述分散2和流动相2的比例为1:10，所述涡旋时间为1-2分钟。

31、在某些实施方式中，步骤a3所述的微液滴1放置在含有冰块的保温泡沫箱中，静置1-3个小时等待微液滴内部交联；

32、在某些实施方式中，步骤b3所述微液滴2放置在37℃水浴中，静置1-3个小时等待微液滴内部交联。

33、在某些实施方式中，步骤3)所述的材料g的制备包括以下步骤：

34、将聚合物材料溶解于去离子水中，第一次加入半胱氨酸盐酸盐和催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，期间用1摩尔每升的盐酸溶液调节反应液ph值为酸性；搅拌反应15-45分钟后，重复上述操作加入第二次次半胱氨酸盐酸盐和催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)；继续搅拌反应15-45分钟后，重复上述操作加入第三次半胱氨酸盐酸盐和催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，反应15-45分钟后将反应液进行透析后冻干，得到半胱氨酸盐酸盐改性的聚合物材料。

35、在某些实施方式中，步骤3)所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲?；⑺犸?；所述光引发剂在材料g的pbs溶液中的浓度为0.5-5mg/ml；所述的半胱氨酸盐酸盐改性的聚合物材料在混合微凝胶中的浓度为0.2-5％。

36、本发明的另一目的是提供由以上所述的制备方法制得的一种降解异质性的微凝胶组装体支架。

37、本发明的再一目的是提供所述解异质性微凝胶组装体支架在药物控释和组织再生修复中的应用。

38、与现有技术相比，本发明具有以下特点：

39、本发明利用巯基和降冰片烯之间能够在光引发剂存在下通过紫外光照发生硫醇-烯点击反应生成的共价键来组装微凝胶支架，反应条件迅速且温和，可以适用于组织工程。同时发明设计了两种降解程度不同的微凝胶，快速降解微凝胶能够进行一个快速的降解在微凝胶组装体支架内产生“巢穴”为细胞聚集成团提供充足的空间并且实现药物的智能控释，慢速降解微凝胶则缓慢降解以匹配细胞外基质的重塑和组织再生的需要。