利西那肽前体的融合蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及蛋白表达，具体而言，涉及一种利西那肽前体的融合蛋白及其应用。

背景技术：

1、利西那肽的c端为nh2，经微生物重组表达获得的利西那肽前体的c端为cooh，需要经化学修饰后得到最终的利西那肽。目前利西那肽前体主要通过化学法偶联合成和重组表达获得。其中，化学法偶联合成工艺复杂且合成过程中易产生杂质，且化学试剂有毒，可能产生消旋体，纯度和回收率相对较低；合成周期较长，产品的质量控制比较困难。重组表达采用基因工程的技术手段在原核或真核生物中引入目标基因表达元件，通过微生物发酵可以实现目标多肽的高效合成。包括包涵体表达和可溶表达两种，其中包涵体表达在变性和复性的过程要用到大量变性剂如尿素或盐酸胍，纯化工艺复杂导致最终得率非常低。而可溶表达，由于引入的标签蛋白及连接标签蛋白及目的肽之间的酶切位点的种类不同，对得到的融合蛋白可溶性及目的肽产量存在一定的影响。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种利西那肽前体的融合蛋白及其应用，以解决现有技术中制备利西那肽前体的效率较低的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种利西那肽前体的融合蛋白，融合蛋白包括利西那肽前体以及融合在利西那肽前体n端的标签蛋白；利西那肽前体具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列；标签蛋白选自如下的任一种：fh8标签蛋白、ffu209标签蛋白、cbm标签蛋白、sumo标签蛋白或trx标签蛋白。

3、进一步地，上述融合蛋白具有seq?id?no:2、seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?idno:7或seq?id?no:8所示的氨基酸序列。

4、为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种制备利西那肽前体的方法，方法包括：制备获得上述的融合蛋白；利用蛋白内切酶切除融合蛋白中的标签蛋白，得到利西那肽前体。

5、进一步地，上述蛋白内切酶选自ulp1酶或kex2酶；ulp1酶与融合蛋白的质量比为1:20-100；kex2酶与融合蛋白的质量比为1:40-500。

6、进一步地，上述制备获得上述的融合蛋白包括：将上述的融合蛋白与伴侣蛋白进行共表达，得到融合蛋白；伴侣蛋白的表达质粒包括：pgro7、ptf16、pkje7或pg-kje8。

7、进一步地，上述利用蛋白内切酶切除融合蛋白中的标签蛋白后，还包括对蛋白内切酶处理后的产物进行进一步纯化，得到利西那肽前体；纯化包括：调节酶切体系ph值至标签蛋白的等电点后，加入有机试剂进行离心，所得上清液即为利西那肽前体。

8、为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种dna分子，dna分子编码上述的融合蛋白。

9、进一步地，上述dna分子的核苷酸序列为经密码子优化后的核苷酸序列。

10、进一步地，上述dna分子具有如seq?id?no:3所示的核苷酸序列。

11、为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种重组质粒，重组质粒连接有上述的dna分子。

12、为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种宿主细胞，宿主细胞内转化有上述的重组质粒。

13、进一步地，上述宿主细胞为原核细胞或酵母细胞。

14、为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种上述的融合蛋白或上述的方法制备得到的利西那肽前体在制备利西那肽中的应用。

15、应用本发明的技术方案，本申请融合蛋白中的利西那肽前体融合有标签蛋白，具有较高的表达量，能够以较为简单的方法制备得到大量、高纯度的利西那肽前体，更好地进行利西那肽的工业化生产及应用。

技术特征：

1.一种利西那肽前体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括利西那肽前体以及融合在所述利西那肽前体n端的标签蛋白；

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有seq?id?no:2、seqid?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7或seq?id?no:8所示的氨基酸序列。

3.一种制备利西那肽前体的方法，其特征在于，所述方法包括：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白内切酶选自ulp1酶或kex2酶；

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述制备获得权利要求1或2所述的融合蛋白包括：将所述权利要求1或2所述的融合蛋白与伴侣蛋白进行共表达，得到所述融合蛋白；

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述利用蛋白内切酶切除所述融合蛋白中的标签蛋白后，还包括对所述蛋白内切酶处理后的产物进行进一步纯化，得到所述利西那肽前体；

7.一种dna分子，其特征在于，所述dna分子编码权利要求1或2所述的融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的dna分子，其特征在于，所述dna分子的核苷酸序列为经密码子优化后的核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的dna分子，其特征在于，所述dna分子具有如seq?id?no:3所示的核苷酸序列。

10.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求7至9中任一项所述的dna分子。

11.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞内转化有权利要求10所述的重组质粒。

12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或酵母细胞。

13.权利要求1或2所述的融合蛋白或权利要求3-6中任一项所述的方法制备得到的所述利西那肽前体在制备利西那肽中的应用。

技术总结
本发明提供了一种利西那肽前体的融合蛋白及其应用。其中，融合蛋白包括利西那肽前体以及融合在利西那肽前体N端的标签蛋白；利西那肽前体具有如SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列；标签蛋白选自如下的任一种：Fh8标签蛋白、Ffu209标签蛋白、CBM标签蛋白、Sumo标签蛋白或Trx标签蛋白。本申请的利西那肽前体融合有上述标签蛋白，带有上述标签蛋白的利西那肽前体具有较高的表达量，能够制备得到大量、高纯度的利西那肽前体，更好地进行利西那肽的工业化生产及应用。

技术研发人员：洪浩,詹姆斯·盖吉,张娜,赵军旗,焦学成,岳卓,王姝玉,刘文敬,李艳玲
受?；さ募际跏褂谜撸?/b>天津凯莱英生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/8