专利名称：含原位聚合甲基丙烯酸丁酯预处理整体柱的三维微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于微全分析技术领域，涉及一种用于分离、富集样品的含固相萃取整体柱介 质的三维微流控芯片及其制备方法。
背景技术：
微全分析系统(P-TAS，又称芯片实验室，Lab-on-a-chip)由于其具备可实现分析过程
连续化、集成化、自动化和微缩化的特点，从而能够极大地减少试剂的消耗量、縮短分析 时间、提高分析检测效率，因此，在疾病诊断、生化分析、临床检测等领域获得广泛的应 用。由于实测样品中基底和成分复杂，基体效应与各干扰组分的共存，致使样品预处理过 程多是在微流控芯片外通过离心、过滤、分离等方式实现，不利于微全分析系统的集成化， 尤其是样品的纯化富集等预处理技术更是制约微全分析系统发展的瓶颈之一。
针对现阶段微流控芯片系统中对生物样品的预处理，目前常用的预处理技术有基于堰、 栅栏、柱、筛等微器件构成的过滤式预处理芯片，基于吸脱附原理的开口管、填充柱和整 体柱式固相萃取型预处理芯片，以及基于电场、磁场或声场作用原理的预处理芯片等。与 微流控芯片上的诸多预处理方式相比，整体柱是一种新型的在管内以原位(in situ)聚合 的方式形成的用于分离分析或作为反应器的多孔固相萃取介质，具有双连续结构和双孔分 布两大特点，与传统的多孔微球型柱材料相比，穿透孔的存在使得整体柱材料具有较好的 渗透性和较小的传质阻力。整体柱式固相萃取型预处理芯片可以通过选取不同性质的吸附 剂使分析选择性大为提高，但存在洗脱过程致使预处辟效率降低及集成难等问题。
发明内容
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本发明的目的在于提供一种高效、简便、成本低廉、能用于样品前处理的微流控固相 萃取预处理三维芯片及其制备方法。
本发明提出的微流控芯片由基片和盖片直接封接而成，有效地实现样品前处理整体柱 与微流控芯片微管道网络一体化集成。盖片上设有样品入口、试剂入口和废液出口及固相 萃取预处理微通道，采用PDMS整体浇铸成型法制备而成，固相萃取预处理微通道内采用 紫外光照原位聚合法制备有聚甲基丙烯酸丁酯类整体柱，样品入口设置在固相萃取预处理 微通道的入口端;所述基片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS
为基材，刻蚀有流体混合和反应的微通道网络，微通道网络由样品进入通道、试剂进入通
道共同连接混合反应通道构成；盖片与基片粘接封装后，盖片上的固相萃取预处理微通道 末端与基片上的样品进入通道连通，盖片上的试剂入口连通基片上的试剂进入通道，盖片 上的废液出口位于基片上的混合反应通道末端。
本芯片在盖片上的微通道内采用紫外光照原位聚合法制备聚甲基丙烯酸丁酯类整体 柱；聚甲基丙烯酸丁酯类整体柱是采用适宜比例的甲基丙烯酸丁酯(BMA)为功能单体， 二甲基乙二醇酯(EDMA)为交联剂，偶氮二异丁腈(A旧N)为引发剂，1， 4丁二醇、异丙 醇、甲醇、乙醇、水等作为致孔剂，在365nm的紫外光照的条件下原位聚合聚甲基丙烯 酸丁酯类整体柱；采用掩膜可有效控制整体柱的在微管道中的位置和长度；通过微通道表 面Y-MAPS双官能团试剂改性处理，能有效地解决整体柱材料与管壁的键合问题。所述微 流控预处理芯片，预处理材料可以用于复杂生化样品中待测目标组分纯化富集。
本芯片的制备方法如下
(1) 盖片采用PDMS整体浇铸成型法制作，首先第一次浇铸PDMS，于90'C烘箱内固 化半小时左右得到厚度为0. 3 0. 5mm厚的PDMS膜层，再将直径为75 200y m细金属Pt 丝固定于上述芯片上，第二次浇铸PDMS，在60'C烘箱内固化4小时得到含预处理微通道 的PDMS盖片，并在与基片各微通道口对应位置开有供微流体出入的导液孔。
(2) 以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧垸PDMS为芯片底片 材料，釆用湿法或干法刻蚀有流体混合和反应微通道。
(3) 采用Y-MAPS双官能团试剂处理盖片微通道。处理过程如下先用0.1MNaOH 溶液冲洗微管道；再用重蒸水冲洗至中性，并用50倍柱体积的丙酮冲洗干净；然后将30 XV/V双官能团试剂y-MAPS丙酮溶液注入微通道中，密封，放置过夜；最后用去离子水 冲洗，干燥备用；
在(3)中的芯片微通道中，采用紫外光照原位聚合法制备聚甲基丙烯酸丁酯预处理 整体柱，以隔离紫外光的掩膜控制整体柱的长度和位置，按75%制孔剂和25%预聚物比 例将反应物泵入已经活化处理的微通道内，所述预聚物采用甲基丙烯酸丁酯BMA为功能 单体，二甲基乙二醇酯EDMA为交联剂、偶氮二异丁腈A旧N引发剂，三者按mBMA: mEDMA :mA旧N为59.5X: 39.5%: 1%的质量比例混合，致孔剂采用甲醇和乙醇，两者按V甲醉 :V ^为1 : 1的体积比例混合，在365nm处以18w功率的紫外光在2 10cm照射距离 下照射2 6小时，得到聚甲基丙烯酸丁酯整体柱；
(4) 将(4)制备的盖片与基片直接粘接封装，得到微流控固相萃取预处理芯片。 本发明提出的微流控固相萃取芯片可用于血样中药物(如吩噻嗪类药物等)的净化
和富集。
本发明提出的微流控固相萃取预处理三维芯片具有具有制作简便、成本低廉、高负载 量、低进样量、快速分析、体积小巧的优点，适合复杂生化样品样品的预处理。其中采用 整体浇铸法制备微通道具有制备简单、成本低廉、操作方便等特点，且能克服芯片封装中 封接难、漏液等问题。采用掩膜有效控制整体微柱位置和尺寸，将整体柱分离介质合理地
键合到微流控芯片管道中。芯片盖片中的预处理管道采用了双官能团试剂Y -MAPS对芯片 微通道进行改性修饰，以改善芯片表面性质，使固相萃取介质材料与芯片微通道内壁得到
有效键合。
本发明采用的甲基丙烯酸丁酯有机聚合物整体柱属于疏水作用分离介质材料，主要依 据物质的极性来分离纯化待测样品，而通过改变洗脱溶剂的浓度及运行条件可以有效地获 得良好的洗脱效率。与其他预处理整体柱相比，原位制备的甲基丙烯酸丁酯预处理整体柱 克服了比表面积小、负载容量低、热诱导聚合过程繁琐、通透性不好，预处理效率不高等 不足，具有具有通透性好、柱压低、机械强度高、分析速度快、直接进行实际样品分离、 富集的特点。
本发明提出的整体浇铸法制备含固相萃取预处理单元的PDMS-玻璃微流控芯片，能明 显改善预处理单元在微流控芯片上集成难的问题，且便于芯片上实现光度法、化学发光和 荧光定量检测，是一种制备简单、低成本、含样品预处理单元的微流控固相萃取三维芯片， 其为微全分析系统集成化的发展提供更多的可能性。
图1含原位聚合甲基丙烯酸丁酯预处理整体柱的微流控芯片结构示意图2含原位聚合甲基丙烯酸丁酯预处理整体柱的微流控芯片结构盖片示意图3含原位聚合甲基丙烯酸丁酯预处理整体柱的微流控芯片结构基片示意图中1.样品入口； 2.试剂入口； 3.废液出口；4.样品进入通道；5试剂进入通道； 6混合反应通道7盖片；8基片；A-B.整体柱。
具体实施例方式
本发明提出的微流控固相萃取预处理芯片，其结构如图1所示，整个芯片由基片8和 盖片7直接封接而成，结构尺寸为长(30mm) X宽(20mm) X高(3mm)。图2中盖 片厚度为1 2mm，盖片中固相萃取预处理微通道(A-B整体柱)长为(5 10mm)，管 道直径75 200um;图3中基片厚度为1mm，基片中混合和反应微通道尺寸为长(10 30mm) X宽(50 200um) X深(50 200 um)。
盖片的结构参见图2，盖片上设有样品入口 1、试剂入口 2和废液出口 3及画相萃取 预处理微通道，采用PDMS整体浇铸成型法制备而成，固相萃取预处理微通道内采用紫外 光照原位聚合法制备有聚甲基丙烯酸丁酯类整体柱A-B，样品入口 1设置在固相萃取预处 理微通道的入口端。
基片的结构参见图3，基片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷 PDMS为基材，刻蚀有流体混合和反应的微通道网络，微通道网络由样品进入通道4、试 剂进入通道5共同连接混合反应通道6构成。
盖片与基片粘接封装后参见图1，盖片上的固相萃取预处理微通道末端与基片上的样 品进入通道4连通，盖片上的试剂入口2连通基片上的试剂进入通道5，盖片上的废液出 口 3位于基片上的混合反应通道6末端。
按照图1所设计的结构制作目标芯片。用95%的乙醇清洗玻璃片，以其作为基片， 按照PDMS涸化剂质量比为10: 1配制PDMS浇铸液，搅匀，静置，除去气泡，将其流 涎到玻璃片上，放置到9(TC烘箱中固化半小时，得到PDMS片，再将制做的模具固定在 上述PDMS片上，二次浇铸成型得到样品预处理芯片的盖片。在对应的出口和入口出制作 样品进出口通孔，得到目标盖片。采用玻璃片制作芯片底片，按照图1中芯片结构示意图 制备刻蚀掩膜，按照标准玻璃湿法刻蚀工艺刻蚀所需深度的通道结构；用乙醇清洗载玻片， 采用湿法刻蚀得到含混合和反应微管道的基片。用0.1MNaOH溶液冲洗毛细管以活化管 道内壁；用重蒸水冲洗至中性，并用50倍柱体积的丙酮冲洗干净；然后将双官能团试剂 Y-MAPS丙酮(30%V/V)溶液注入微通道中，密封，放置过夜；最后用去离子水冲洗， 干燥备用。微管道分别采用NaOH、重蒸水、丙酮和双官能团试剂Y-MAPS丙醇(30% V/V)活化处理，干燥备用；按75%制孔剂(mBMA : m瞧m顯为59.5%: 39.5%: 1%) 和25X预聚物(V鸭V乙醉为1 : 1)比例将聚合液泵入已经活化处理的微通道内，在365nm 处以18w(功率)紫外光照下聚合4小时得到有机聚合物整体柱，用乙醇洗涤，于6(TC温度 下干燥，待用。制得聚合整体柱的孔容可达到0.31cm2，g'1， BET比表面积达到365.72 m2 g—1， SEM测试图谱显示聚合物由3 5pm的微球和一定尺寸的微孔组成。 本芯片的使用实例
本微流控固相萃取三维芯片可通过光电倍增管(PMT)、电荷耦合器件(CCD)和光纤等方式 采集数据，与多种检测方法集成。以血液中的盐酸丙米嗪药物为实测样品，利用强酸性的 高锰酸钾-乙二醛-丙米嗪化学发光体系进行测定。样品用注射微泵从预处理整体柱通道的 入口端进样，以2. OmLAiin的流速经预处理整体柱，被测物质被固相萃取材料吸附，用一 定体积的洗脱液冲洗整体柱，最后用样品洗脱液将被测物质从固相载体上洗脱下来；同时， 在反应试剂入口端以同样的速度泵入反应试剂(发光试剂)，在反应通道的末端检测信号。
实验结果显示聚甲基丙烯酸丁酯类整体柱对血液中盐酸丙米嗪有明显的分离富集效果， 其富集倍数达到10倍以上，本设计芯片分析系统的检出限可达到5X 10—8g/mL。
权利要求
1、一种含原位聚合甲基丙烯酸丁酯预处理整体柱的三维微流控芯片，所述芯片由基片和盖片封接而成，其特征在于所述盖片设有样品入口、试剂入口和废液出口及固相萃取预处理微通道，采用PDMS整体浇铸成型法制备而成，固相萃取预处理微通道内采用紫外光照原位聚合法制备有聚甲基丙烯酸丁酯类整体柱，样品入口设置在固相萃取预处理微通道的入口端；所述基片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS为基材，刻蚀有流体混合和反应的微通道网络，微通道网络由样品进入通道、试剂进入通道共同连接混合反应通道构成；盖片与基片粘接封装后，盖片上的固相萃取预处理微通道末端与基片上的样品进入通道连通，盖片上的试剂入口连通基片上的试剂进入通道，盖片上的废液出口位于基片上的混合和反应通道末端。
2、 根据权利要求1所述的三维微流控芯片，其特征在于所述盖片中固相萃取预处 理微通道长为5 10mm，微通道直径75 200um，基片中混合和反应微通道尺寸为长 10 30mmX宽50 200u mX深50 200 um。
3、 权利要求1所述的三维微流控芯片的制备方法，包括以下步骤(1) 盖片采用TOMS整体浇铸成型法制作，首先第一次浇铸PDMS，于90。C烘箱内固 化半小时左右得到厚度为0. 3 0. 5mm厚的PDMS膜层，再将直径为75 200y m细金属Pt 丝固定于上述PDMS膜层上，第二次浇铸PDMS，在6(TC烘箱内固化4小时得到含预处 理微通道的PDMS盖片，并在与下述基片各微通道口对应位置开有供微流体出入的样品入 口、试剂入口和废液出口；(2) 以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧垸PDMS为芯片基片材 料，采用湿法或干法刻蚀有流体混合和反应的微通道网络，微通道网络尺寸为长10 30mmX宽5。 200u mX深50 200 um;(3) 采用y-MAPS双官能团试剂处理盖片中微通道，处理过程如下先用0.1MNaOH 溶液冲洗微通道；再用重蒸水冲洗至中性，并用50倍柱体积的丙酮冲洗干净；然后将30 XV/V双官能团试剂y-MAPS丙酮溶液注入微通道中，密封，放置过夜；最后用去离子水 冲洗，干燥备用；(4)在盖片的微通道中，采用紫外光照原位聚合法制备聚甲基丙烯酸丁酯预处理整体 柱，以隔离紫外光的掩膜控制整体柱的长度和位置，按75%制孔剂和25%预聚物比例将 反应物泵入已经活化处理的微通道内，所述预聚物采用甲基丙烯酸丁酯BMA为功能单体， 二甲基乙二醇酯EDMA为交联剂、偶氮二异丁腈A旧N引发剂，三者按mBMA : mEDMA : mA旧N为59.5。/^: 39.5%: 1%的质量比例混合，致孔剂采用甲醇和乙醇，两者按V甲醉V 乙醇为1 : 1的体积比例混合，在365nm处以18w功率的紫外光在2 10cm照射距离下照 射2 6小时，得到聚甲基丙烯酸丁酯整体柱；(5)将步骤(4)制备的盖片与步骤(1)制备的基片直接粘接封装，使盖片上的固 相萃取预处理微通道末端与基片上的进样通道连通，盖片上的试剂入口连通基片上的试剂 进入通道，盖片上的废液出口位于基片上的混合反应通道末端，即得到微流控固相萃取预 处理芯片。
全文摘要
本发明属于微全分析技术领域，涉及一种含原位聚合甲基丙烯酸丁酯预处理整体柱的三维微流控芯片，在微流控芯片上的微通道内采用紫外光照原位聚合法制备聚甲基丙烯酸丁酯类整体柱，微流控芯片的基片可采用玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS等为基材，刻蚀有流体混合和反应的微通道网络；盖片采用整体浇铸PDMS法制作集固相萃取预处理单元的微通道，在与基片各微通道口对应位置开有供微流体出入的导液孔，并与基片直接键合，实现样品预处理整体柱与微流控芯片微管道网络一体化集成。本芯片具有制作简便、成本低廉、进样量少、分离分析快速的优点，适合复杂生化样品样品的预处理和分析测试。
文档编号G01N33/48GK101358912SQ20081007030
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月17日 优先权日2008年9月17日
发明者张文品, 溢 徐, 徐平洲, 强 曹, 萍 曾 申请人:重庆大学