阿尔茨海默病早期诊断的自支撑式纳米纤维膜传感器的制备方法

本发明属于电化学生物传感器，涉及一种用于临床早期阿尔茨海默病诊断的自支撑式纳米纤维膜传感器的制备方法。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(ad)是一种不可治愈的、不可逆转的进行性脑部疾病，全世界超过10%的老年人口受到影响，到2050年这一数字将达到1.5亿。ad的发生没有明确的原因，但这种疾病有一些关键的危险因素，如年龄超过65岁，遗传(存在apoe-4基因)，唐氏综合症患者，一些基因突变，以及家族史。由于ad的治疗选择非常有限，因此迫切需要找到有效的策略，使患者能够在早期接受适当的治疗，提高ad的存活率并减轻患者的痛苦。据研究发现，ad的发展导致aβ寡聚体的异?；?，导致正常神经元的丧失。脑脊液和血液中aβ寡聚体的可及水平是ad诊断和预后的重要生物标志物。

2、传统上，有两种成熟的技术来检测aβ的形成：一种是利用正电子发射断层扫描来显示大脑中的区域分布，另一种是通过腰椎穿刺法收集脑脊液。然而，上述两种方法都存在成本高和操作困难的缺点，尤其是脑脊液提取，手术风险较高，难以对潜在的阿尔茨海默病患者进行早期和现场筛查。为了解决上述问题，已发展了几种血液检测方法来检测ad诊断中的aβ水平，如酶联免疫吸附试验(elisa)、免疫沉淀-质谱仪(ip-ms)和免疫组织化学(ihc)。这些方法经常面临耗时(通常2-5小时)、成本高、仪器笨重和检测特异性不令人满意的缺点。因此，迫切需要一种新的血液检测技术来实现快速、低成本、高灵敏度的aβ检测，而不依赖庞大的设备仪器支持。

3、电化学生物传感器能够高选择性地灵敏地检测体液中的痕量生物标志物。此外，它的设备很容易小型化到便携式或手持式配置，用于医疗点或非医院分析。其中适配体传感器采用了与特定蛋白质或非蛋白质小分子结合的寡核苷酸探针，提供了超低的检测极限和快速的响应时间。通常，适配子传感器的性能取决于识别策略和电极材料。对于aβ检测，标记和非标记适配子作为探针是靶标结合和信号产生的两种主要策略。对于标记的适体传感器，通常使用荧光染料、酶、生物素或胺化化合物为dna或rna探针提供电化学信号源。这种方法能够产生有利于灵敏度的强烈的电化学反应。然而，由于报告分子的进一步修饰，寡核苷酸的高成本、长结合时间和多步骤一直阻碍了标记适体传感器的大规模应用。因此，无标记适体传感器正受到越来越多的关注，以克服上述不足。然而，由于缺乏信号报告，这种生物传感器的信号强度很弱，因为它是由寡核苷酸与靶蛋白结合而产生的。因此，开发兼具高催化活性和优异导电性的纳米传感材料并设计高效的标记物检测策略是构建高性能无标记适配体生物传感器来提高ad早期诊断的决定性步骤。

技术实现思路

1、本发明针对传统阿尔茨海默病临床诊断设备中存在的问题提出一种新型的用于阿尔茨海默病早期诊断的自支撑式纳米纤维膜传感器的制备方法。

2、为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

3、一种用于阿尔茨海默病早期诊断的自支撑式纳米纤维膜传感器的制备方法，步骤如下：

4、（1）电纺聚酰胺(pa)纳米纤维膜制备

5、将聚酰胺(pa)粉末加入到甲酸溶剂中，室温条件下搅拌过夜，得到均匀纺丝液，均匀纺丝液静电纺丝后真空干燥，得到电纺聚酰胺(pa)纳米纤维膜。

6、（2）自支撑式纳米纤维膜pa/pani-cnts的制备

7、采用低温化学氧化聚合工艺，在电纺pa纳米纤维表面原位合成导电聚合物pani。首先，电纺pa纳米纤维膜在苯胺和过硫酸铵的混合溶液（硫酸为溶剂）中低温反应，低温氧化聚合后采用去离子水洗涤、真空干燥，得到pa/pani纳米纤维。为了给dna探针提供接枝位点并进一步放大传感信号，再将pa/pani纳米纤维膜置于羧基碳纳米管(cooh-cnts)溶液中浸泡，然后采用去离子水洗涤、真空干燥，得到自支撑式纳米纤维膜pa/pani-cnts。

8、（3）适配体生物传感器的制备

9、自支撑式纳米纤维膜pa/pani-cnts置于edc和nhs的混合溶液中进行活化，活化完成后取出置于氨基修饰的单链dna探针溶液中进行孵育，然后采用去离子水冲洗，得到适配体生物传感器，可以直接进行使用，也可以低温4℃下保存备用。

10、作为优选，步骤（1）均匀纺丝液中聚酰胺(pa)质量浓度为10-24wt%，纺丝参数如下：纺丝负电压为-（1-3）kv，正电压为18-26?kv，纺丝距离为18-22cm，纺丝液的流速为0.8-1.6ml/h，环境温度为20-25℃，环境湿度为40-50％；真空干燥的真空度为0.1mpa，真空干燥温度为60℃，真空干燥时间至少为12h。

11、作为优选，步骤（2）苯胺和过硫酸铵的混合溶液中苯胺的浓度为0.1-1m，过流酸铵的浓度为0.1-1m，溶剂为硫酸。低温氧化聚合反应的温度为2℃，时间为1-8h。羧基碳纳米管(cooh-cnts)溶液的质量浓度为0.1-0.3wt%，pa/pani纳米纤维膜浸泡在羧基碳纳米管(cooh-cnts)溶液中的时间为10-60min，去离子水洗涤3次；真空干燥的真空度为0.1mpa，真空干燥温度为60℃，真空干燥时间至少为6h。

12、作为优选，步骤（3）混合溶液中edc的浓度0.1-0.3m，nhs的浓度0.05-0.2m；氨基修饰的单链dna探针溶液浓度为2-10μm，孵育时间12-20h；氨基修饰的单链dna探针序列为5′–nh2-(ch2)6-ccgg?tggg?ggac?cagt?acaa?aagt?gggt?aggg?cggg?ttgg?aaaa-3′。

13、本发明基于静电纺丝工艺和低温氧化聚合作用成功制备出了具有极大比表面积、优异电催化性能和良好导电性的pa/pani纳米纤维膜。聚苯胺由于其π-π共轭键而具有良好的导电性，是一种优异的电化学材料。然而，聚苯胺不能提供相应的官能团来通过化学键固定适配体。因此，本发明引入了碳纳米管作为锚点，以提供丰富的-cooh，用于负载适体。羧基碳纳米管(cooh-cnts)通过逐层自组装在聚苯胺表面原位沉积，得到自支撑式纳米纤维膜pa/pani-cnts。这种自支撑式纳米纤维膜结构具有极大的比表面积和丰富的官能团，以及独特的三维网络电子传输通道，可用于电化学信号放大并且可以显著提升适配体分子的负载量。此外，为了实现真实血样中痕量aβ的超灵敏和准确识别，本发明采用由dna探针构型变换引起信号放大的策略来捕获aβ。在这项工作中，基于dna探针的-nh2基团与自支撑式纳米纤维膜pa/pani-cnts的-cooh的反应，本发明设计的与aβ蛋白特异性结合的单链dna探针被固定在膜上作为铺获探针和报告分子。当aβ存在于真实血样中时，dna的碱基序列可以通过亲和效应以及空间构型的变化来特异性地识别和捕获aβ形成apt-aβ复合体。然后，由于dna构型的改变，apt-aβ复合体将远离材料表面，导致膜表面阻力减小电化学信号上升。该适配体生物传感器在aβ的定量分析中具有极低的检出限(30?fg/ml)和超宽的线性范围(0.1-110ng/ml)。更重要的是，检测过程最快只需4分钟，在检测真实血清样本时表现出卓越的可靠性和准确性。同时也具有能够满足其他疾病标记物分子分析的可能性，为快速、灵敏地检测多种疾病生物标志物和临床医疗中疾病的早期筛查及术后追踪提供了一种新的高效的分析检测方法，在疾病诊断和临床生物医学中具有重要的应用价值。

14、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

15、1.?本发明基于静电纺丝工艺和低温氧化聚合作用成功制备出了具有极大比表面积、优异电催化性能和良好导电性的自支撑式纳米纤维膜pa/pani-cnts，为dna探针负载提供了丰富的活性中心。

16、2.?本发明基于碱基序列的特异性识别原理，设计了一种由dna探针构型变换引起的信号放大策略可实现血清中微量aβ超灵敏、选择性的检测。

17、3.?本发明基于自支撑式纳米纤维膜pa/pani-cnts并结合dna探针构型变换信号放大策略构建了高性能无标记适配体生物传感器，表现出优异的电催化活性和电子传递能力，最快能够在4?min内实现真实血样中aβ的高灵敏度检测，具有较低的检测极限和较宽的线性范围，极大地提升了ad早期诊断的精准度和效率。

18、4.?aβ适体传感器在成分复杂的实际血清样品检测中仍表现出良好的准确性、稳定性和抗干扰性。同时，该适配体传感器有望实现对其他生理物质的精确检测，如血清电解质和疾病生物标志物。

19、5.?该适配体电化学生物传感器制备过程简易可控，易于实现规?；?、产品化生产，大大简化了疾病标记物的检测步骤，缩短了检测时间。