血清/浆中PSGAs自身抗体在糖尿病肾病早期诊断中的应用的制作方法

本发明属于生物医药检测，涉及血清/浆中psgas自身抗体在糖尿病肾病早期诊断中的应用。

背景技术：

1、糖尿病肾病(diabetic?nephropathy,dn)是糖尿病的主要微血管并发症，也是终末期肾病的最常见病因及心血管事件的独立危险因素之一。糖尿病患者并发dn的病死率是没有并发dn者的30多倍。糖尿病病人肾病的发生率与糖尿病的病程有关。1型糖尿病病人病程＜5年者dn发生率较低，但病程20～25年者发生率为40％～50％。2型糖尿病病人病程25年，患病率可达50％以上。由于导致糖尿病到糖尿病肾病的因素复杂，机制不清，同时缺乏可用于对其早期诊断和实时跟踪的特异生物标志物，知晓率较低，糖尿病患者一旦发生肾脏损害，出现持续性蛋白尿则病情常不可逆转，往往发展至终末期肾衰竭。因此，寻求早期诊断和有效的治疗是临床和基础研究共同关注的问题。

2、根据dn的病程和病理生理演变过程，dn可分为5个不同阶段。i期：肾小球高滤过和肾脏肥大期，肾小球滤过率(gfr)高于正常的25％～40％，肾脏体积增大约20％，此期与高血糖水平一致，没有病理组织学损伤，血糖控制后可以得到部分缓解。ⅱ期：运动后微蛋白尿期，尿蛋白排泄率正?；蛟硕笤龈??？捎谢啄ぴ龊窈拖的だ┱?。ⅲ期：持续性微量白蛋白尿期，此期gfr仍能维持正常，病变仍为可逆性，若不积极干预，大多数患者病情逐渐进展。ⅳ期：临床糖尿病肾病期或显性蛋白尿期，gfr多下降，有典型dn病理改变。ⅴ期：肾功能衰竭期，病理为肾硬化症。由于糖尿病肾病早期可无症状，多数糖尿病肾病早期患者不去就诊，当出现症状时往往已发展到不可逆转的糖尿病肾病中晚期而失去治愈的可能。尿白蛋白的出现是临床上对dn的最早可检测阶段，一旦出现临床蛋白尿，肾功能将呈进行性下降。研究结果表明dn早期接受治疗的2型糖尿病患者从正?；蛭⒌鞍啄蚪锥喂傻降鞍啄蚪锥蔚谋壤蟠蠼档?，因此尽早发现微量白蛋白尿，进行有效的治疗，可以延缓或逆转病情，避免临床dn的发生发展。测定24h尿微量白蛋白是目前常用的诊断早期dn的方法，国内外大量研究证实24小时尿微量白蛋白可以反映肾小球早期的轻微损害，是目前国内外公认的诊断早期dn的一项可靠的指标。但是有研究发现，部分糖尿病患者尿白蛋白水平在正常范围时发生了肾功能的改变。因此尿蛋白作为标志物漏诊率较高。此外，近些年来发现，由于糖尿病患者在肾功能早期病变过程中，有一些尿中的特种蛋白，如尿视黄醇结合蛋白(rbp)、尿tamm-horsfall糖蛋白(thp)、转铁蛋白(trf)等已往往显著增高，虽然这些蛋白质在尿中的绝对含量很低，而且绝大部分(尿清蛋白除外)即使到疾病的晚期也不能构成总尿蛋白的显著增高，故测定上述尿中特种蛋白，对早期糖尿病肾病的诊断会有一定帮助，但这些标志物对糖尿病肾病的预测灵敏度和特异性较差，临床认可度和使用率也较低。因此，dn作为糖尿病患者最常见的一种慢性并发症，早期正诊断及干预治疗尤为重要。虽然dn检测指标很多，但临床上仍缺乏行之有效的、无创性的、简便易行的dn早期检查方法来帮助患者早期诊断，预防dn的发生发展，减少终末期肾病的发生。因此寻找dn早期诊断标志物不仅将会减轻患者的痛苦和社会的经济负担，还可为临床提供更多的理论依据。

3、在对不同肾病的研究中，人们发现针对肾脏足细胞磷脂酶a2受体(pla2r)的自身抗体在特发性膜性肾病的发生发展中起重要作用?；谕脑?，我们提出针对肾脏足细胞表面特定糖化修饰的抗原的自身抗体可能也在糖尿病向糖尿病肾病的进展中起到重要作用。支持这一假说的是大量文献报导补体的激活参与了足细胞的损伤和dn的发生发展，而补体的激活需要抗体的存在。由于糖尿病中，各种蛋白因为糖基化修饰，会产生各种糖基化终产物。这些糖基化终产物呈高度异质性，主要包括羧甲基赖氨酸(cml)、戊糖素(pentosidine)、羟甲基赖氨酸(cel)等。和正常的蛋白相比，糖化后的蛋白有较高的抗原性，在特定状况下(如炎症)，可以作为抗原引起机体产生针对糖化蛋白的自身抗体。国内外研究者曾直接使用体外合成的ages作为抗原来检测dn患者血清中是否含有针对ages的自身抗体，取得了一定的效果。但更深入系统的研究表明ages不能作为抗原来对dn的进展进行早期准确的检测，主要原因是ages一般出现在糖尿病的晚期，且广泛存在于各种组织(包括各种体液)，而且其抗体的灵敏度低。我们在前期研究中也制备了各种人源的ages并用作抗原来检测dn患者血清中的自身抗体，发现ages对dn患者血清中的自身抗体辨识度很低。因此需要开发新的具有更高灵敏度和准确度的标志物用于dn的早期诊断。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供检测血清/浆中psgas自身抗体的试剂的应用。

2、本发明的另一目的是提供一种递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞及其制备方法。

3、本发明的又一目的是提供递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞的应用。

4、本发明是基于以下科学发现所做出的：

5、当我们用dn患者血清对正常肾组织和dn患者肾组织切片进行免疫荧光染色时，始终发现dn患者血清能专一标记dn患者的肾小球，而不标记正常人肾小球。作为对照，糖尿病患者血清对dn和正常肾组织均不标记(图1)。这一结果清楚地表明dn患者血清中存在针对肾小球中足细胞表面特定抗原的自身抗体，该自身抗体不是针对ages，而是靶向足细胞递呈的糖化蛋白片段(通常8-20氨基酸)。由于这一自身抗体和dn的发生发展有密切关系，检测这一自身抗体的产生及水平可以获悉dn进展的情况。dn患者肾组织切片可以直接作为组织抗原对患者血清中自身抗体进行检测。在免疫荧光标记实验中，标记肾小球的血清才是阳性血清，而依据标记的荧光强度可以判定自身抗体的水平。

6、另外，我们近年来的研究表明足细胞具有抗原递呈细胞的功能，通过吞噬，处理和递呈不同抗原，足细胞可以选择性和特异亚群t细胞相互作用(li?s?et?al,jp；li,l?etal，jci?insight)。这些结果证明足细胞可以吞噬抗原并主动递呈剪切后的抗原片段到细胞表面。我们进一步的研究还发现了调控足细胞吞噬，处理和递呈抗原能力的一系列分子机制。比如，敲降足细胞sirpα可以增强其抗原的吞噬和处理(图2)以及将处理后的抗原片段向细胞表面的递呈(图3)。因此，在特定环境下，培养的人足细胞可吞噬，处理和递呈不同人源糖化蛋白。我们首次将这些足细胞递呈的糖化蛋白片段抗原命名为足细胞特异糖化抗原psgas(podocyte-specific?glycated?antigens)。这样表达有psgas的人源足细胞可作为细胞抗原来替代肾组织对患者血清中自身抗体进行检测。

7、鉴于上述原因，本发明首先从自身抗体在dn发生发展中的致病作用出发，揭示各类糖化修饰的蛋白质在一定条件(高糖，感染，炎症等)下可被抗原递呈细胞吞噬，处理并递呈抗原给t细胞和b细胞，最后产生针对其的自身抗体。由于足细胞在高糖刺激及炎症状况下也可以吞噬，处理并递呈类似的抗原片段(psgas)，导致足细胞成为这些自身抗体的敏感靶标。自身抗体可以介导补体系统和t细胞对表达抗原的细胞进行攻击，因此针对psgas的自身抗体识别并破环肾脏足细胞，从而引起肾损伤，导致糖尿病肾病。我们所揭示的psgas自身抗体产生和致病机理如图4所示。在此基础上，本发明表明糖尿病肾病患者和糖尿病肾损伤模型小鼠血清中针对足细胞表面psgas的自身抗体不仅是糖尿病肾病发生发展的重要因素，同时也可作为糖尿病发展到糖尿病肾病的早期诊断生物标志物。

8、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

9、一种制备递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞的方法，包含以下步骤：

10、1)将人源足细胞系体外培养并分化成熟，并加入1mg/ml?lps刺激活化人源足细胞12小时；

11、2)糖基化终末产物的制备：将葡萄糖、1m磷酸钠缓冲液30％hsa溶液和ddh2o混匀并过滤，放入37℃培养箱避光孵育80-100天，期间调节ph值，使ph值稳定在7.4，此过程中注意无菌，孵育后的产物用0.02m?pbs充分透析以除去游离的葡萄糖及hsa，获得糖基化终末产物备用；

12、3)将步骤1)制备的人源足细胞、使用浓度为5ug/ml的步骤2)制备的糖基化终末产物以及80-200ng/ml酪氨酸磷酸酶抑制剂1(tyrosine?phosphatase?inhibitor1，tpi-1)在37℃下共同孵育20-28小时；

13、4)生理盐水冲洗人源足细胞，除去残余糖基化终末产物，并用4％多聚甲醛固定3-5分钟，获得递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞。

14、作为本发明的一种优选，步骤2)所述的人血清白蛋白和葡萄糖的质量比为1：1.81，制备好的糖基化终末产物的浓度为2.5mg/ml。

15、作为本发明的一种优选，步骤2)所述的温育时间为90天。

16、作为本发明的一种优选，步骤3)中所述的酪氨酸磷酸酶抑制剂1的终浓度为:100-120ng/ml，进一步优选100ng/ml。

17、按照本发明所述的方法制备的递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞。

18、本发明所述的递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞在制备糖尿病肾病早起辅助诊断试剂中的应用。

19、本发明所述的递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞在制备糖尿病患者向糖尿病肾病发展的风险评估试剂中的应用。

20、一种试剂盒，含有本发明所述的递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞。

21、检测血清/血浆中足细胞特异糖化抗原psgas自身抗体的试剂在制备糖尿病肾病早起辅助诊断试剂中的应用。

22、检测血清/血浆中足细胞特异糖化抗原psgas自身抗体的试剂在制备糖尿病患者向糖尿病肾病发展的风险评估试剂中的应用。

23、有益效果：

24、本发明基于血清中针对足细胞表面psgas的自身抗体可作为糖尿病发展到糖尿病肾病的早期诊断生物标志物，提供了检测血清/血浆中足细胞特异糖化抗原psgas自身抗体的试剂在制备糖尿病肾病早起辅助诊断试剂中的应用。同时本发明提供了制备递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞的方法，及由此法制备的递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞，利用该递呈足细胞特异糖化抗原psgas的人源足细胞可作为细胞抗原来替代肾组织对患者血清中自身抗体进行检测，具有准确度、灵敏度和特异性高的优点。