一种连接酶催化的多肽环化方法及在噬菌体展示肽库中的应用

本发明涉及基因编码的多肽库修饰和侧链环化，具体涉及一种连接酶催化的多肽环化方法及在噬菌体展示肽库中的应用。

背景技术：

1、多肽分子是药物研发的重要来源，已经产生了多种重磅型药物，例如司美鲁肽、胰岛素和特立帕肽等。然而，短链线性多肽在溶液一般无固定的构象，与靶标的结合力相对弱，且易于被蛋白水解酶降解，限制了其在现代多肽药物设计和发现中的应用?；纷粗Ъ艿亩嚯木哂邢喽愿招缘慕峁?，在靶标蛋白结合能力、蛋白水解酶稳定性以及细胞膜通透性等方面已经被证明显著优于线性多肽，代表性例子如环孢素和齐考诺肽。自然界存在一类富含半胱氨酸的环肽活性分子，它们通过多对半胱氨酸的侧链氧化形成二硫键框架的环状，例如芋螺毒素肽。但是，二硫键在还原环境中十分不稳定，与自由巯基会发生硫醇交换，进而导致二硫键框架的错误重排。

2、利用有机小分子偶联多肽序列中的两个或多个氨基酸残基是构建稳定环肽的重要策略。硫醚键能够克服二硫键不稳定的缺点，是替代二硫键进行多肽环化的常用方法。为了确保高效的反应效率，基于硫醚键的多肽环化法需使用高反应活性的亲电体，例如溴甲基苯或者碘甲基苯、溴乙?；蛘叩庖阴；?，来偶联两个或多个半胱氨酸残基。heinis等(参见nat?chembiol?2009,5,502-507)通过三溴甲基苯与三个半胱氨酸侧链反应构建含硫醚键的双环肽，但溴甲基基团在弱碱性条件能与多肽中的其它亲核性基团如氨基发生反应(参见sciadv?2019,5,eaaw2851)。

3、多肽环化的一个重要应用是构建大规模的环肽库用于发现靶标蛋白的环肽配体，特别是用于由基因编码的多肽文库的大环化，例如噬菌体展示的多肽文库。在噬菌体表面多肽环化时，三溴甲基苯会与piii蛋白质的半胱氨酸反应，带来噬菌体侵染性降低的潜在问题。低反应性亲电体例如丙烯?；蚵纫阴；?，能够解决溴乙?；母狈从ξ侍?，但是其引入噬菌体或者mrna展示的多肽文库通常使用了繁琐的密码子拓展(参见angew?chem?inted?engl?2019,58,15904-15909)或者flexizyme技术(参见annu?rev?biochem?2022,91,221-243)或者结构复杂的双功能反应性试剂(参见jam?chem?soc?2020,142,5097-5103)。

4、除了基于半胱氨酸侧链多肽环化方法外，还发展了基于赖氨酸、酪氨酸或色氨酸等的环化修饰方法(参见chem?rev?2020,120,10079-10144)。其中，用于赖氨酸侧链环化的策略采用了琥珀酰亚胺活化酯，其存在不稳定、易水解和副反应严重的缺陷(参见jam?chemsoc2005,127,14142-14143)。此外，还可以引入正交性非天然氨基酸对来进行多肽的环化，例如叠氮和炔烃修饰的氨基酸，但是这些非天然氨基酸引入噬菌体、大肠杆菌或者mrna展示的多肽文库需要繁琐的密码子拓展技术，且受到专利?；は拗?。此外，点击化学通常需要使用金属催化剂(参见angew?chem?int?ed?engl?2009,48,6974-6998)，会带来噬菌体或大肠杆菌的毒性问题，且易于带来环肽的金属离子残留问题。

5、随着人们对环肽药物发现的日益重视，发展与基因编码文库技术兼容的多肽环化方法成为当前基础和应用科学研究的重要趋势?；虮嗦胛目饧际?，包括噬菌体展示、大肠杆菌展示、酵母展示和mrna展示技术，通过构建大规模随机多肽文库针对靶标进行迭代筛选，已经加速了环肽配体的发现进程?；虮嗦攵嚯奈目饧际跻话闶窃诮咏行缘乃芤褐薪?，要求多肽环化方法具有较好的生物相容性。而且，基因编码多肽文库技术的底物浓度极低，要求环化反应具有极高的反应效率和高度的选择性。这些苛刻的条件使得常用的化学环化方法要么不适用于基因编码的多肽文库技术，要么达不到预期的效果。

6、sortasea酶是从革兰氏阳性菌中分离出来的一种转肽酶，能够诱导两个多肽以序列特异性方式酰胺键共价连接。具体来说，在sortasea酶存在下，含leu-pro-xxx-thr-gly(其中xxx为任何一种天然氨基酸)的一个多肽与另一个n端含甘氨酸的多肽会以肽键连接(参见angew?chem?int?ed?engl?2011,50,5024-5032)。与常用化学法修饰多肽相比，基于sortasea酶的反应具备反应条件更加温和特异性更高的优点。然而，报道的基于sortasea酶的修饰反应均用于实现多肽主链的酰胺键连接(commun?chem?2023,6,48)，尚未实现多肽侧链的环化。虽然sortasea酶连反应在蛋白质修饰和半合成领域得到广泛使用，但尚未用于基因编码环肽文库的构建，例如噬菌体展示环肽库。综上所述，深入探索sortasea酶催化连接体系，开发基于sortasea酶催化的多肽侧链环化新体系，并应用于基因编码多肽文库的环化，将有助于大环肽配体的发现。

技术实现思路

1、针对基于二硫键的多肽环化法存在环肽产物在还原条件下不稳定以及易于发生二硫键错误重排的缺点，同时针对大多数化学环化法存在反应条件苛刻和生物兼容性差且不适合修饰基因编码的多肽文库例如噬菌体展示文库，本发明提供了一种反应条件温和、反应效率和特异性高的sortasea催化的多肽侧链环化方法。

2、为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

3、一种连接酶催化的多肽环化方法，所述连接酶催化的多肽环化方法包括以下步骤：

4、s1、制备侧链含低反应性基团的sortasea酶识别的多肽类化合物，且该化合物具有以下结构通式：

5、

6、其中，xa为氢、乙?；?、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种；xb为亲电体基团、含亲电体基团的由天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种，其中亲电体基团包括氯乙?；?、3,5-二[(2-氯乙?；?氨基]苯甲?；?；xc为氧(氧酯键)、氮氢(酰胺键)、硫(硫酯键)中的任意一种，xd为氨基、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽序列中的任意一种；n为1～5之间任何一个数目；

7、s2、利用以上多肽类化合物在sortasea酶存在条件下与n-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板在缓冲盐溶液中发生多肽连接和多肽侧链环化，产生环肽分子；

8、s3、选取s2中的n-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板，通过基因编码融合表达在噬菌体piii蛋白质的n末端，再经过s2步骤操作来构建噬菌体展示的环肽库，并针对靶标蛋白筛选环肽配体。

9、优选的，所述s2中多肽模板为以下两种：

10、模板a：g-(x)m-c；模板b：g-(x)m-c-(x)y-c；

11、其中，模板a用于构建单环肽，模板b用于构建双环肽，g代表甘氨酸，x代表任意一种天然l-氨基酸，c代表l-半胱氨酸且位置可以根据要求改变，m和y代表3～20之间的氨基酸数目。

12、优选的，所述sortasea酶是其野生型或者突变体。

13、优选的，所述s2中多肽类化合物的浓度范围为0.1μm～10.0mm，sortasea酶的浓度范围为0.1μm～10.0mm。

14、优选的，所述s2中的缓冲盐溶液为除磷酸盐外的常用缓冲液，包括hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、naoac(乙酸钠)和tris(三羟甲基氨基甲烷)中的任意一种，其中含cacl20.1?mm～10mm，和tcep(三(2-羧乙基)膦)0.1μm～10.0mm，ph范围为6.0～9.0。

15、优选的，所述s2中多肽连接和多肽侧链环化反应的时间为15分钟～6小时，反应温度为20～45℃。

16、优选的，所述s3中的噬菌体包括由pcantab?5e噬菌粒和辅助噬菌体m13ko7组成的噬菌体系统或m13ke噬菌体系统。

17、优选的，所述s3中针对靶标蛋白筛选环肽配体包括以下步骤：

18、s3-1、利用所述的连接酶催化的多肽环化方法构建噬菌体展示的单环肽或双环肽文库；

19、s3-2、靶标蛋白被生物素化，固定在磁珠上，所述s3-1中噬菌体展示的单环肽或双环肽文库与固定化的靶标蛋白共孵育，经过2～4轮生物淘选，对生物淘选后的噬菌体颗粒进行测序；

20、s3-3、根据测序结果合成富集的目标环肽，评价与靶标蛋白的结合力和生物活性。

21、上述多肽环化应用于基因编码环肽文库的构建，包括对噬菌体展示的多肽文库进行多肽连接和侧链环化，构建噬菌体展示的单环和双环肽库。

22、优选的，所述连接酶催化的多肽环化方法得到的环肽配体应用于药物、检测试剂盒或其它生物医学和生物材料的开发。

23、本发明提供一种连接酶催化的多肽环化方法及在噬菌体环肽文库中的应用，与现有技术相比优点在于：

24、(1)本发明与现有的sortasea酶催化的多肽连接技术相比，首次利用sortasea酶介导生成了侧链到侧链的环肽，本发明中多肽侧链环化是多肽连接产生的中间体结构中的亲电体基团与半胱氨酸残基之间的环化反应，从而构建环肽分子，并且本发明也是首次用于构建噬菌体展示的环肽库。

25、(2)本发明与传统的化学法构建环肽文库技术相比，不需要高反应活性的亲电体，不会产生噬菌体毒性，更加有利于噬菌体编码的多肽文库的环化修饰。

26、(3)本发明与已有的基于密码子拓展或者flexizyme的环肽文库技术相比，不涉及复杂的密码子改造，不需要制备非天然氨基酸修饰的trna，大大减少环肽文库构建的成本。

27、(4)本发明的酶催化多肽侧链环化方法整体反应条件温和、反应效率高和特异性高，其产生的噬菌体环肽文库能够用于筛选新结构框架的功能性环肽配体，为生物医药和生物材料领域提供了强大的平台技术。