用于靶向敲除NKG2A基因的sgRNA及制备敲除NKG2A的NK细胞的方法和应用与流程

本发明属于基因工程，具体涉及用于靶向敲除nkg2a基因的sgrna及制备敲除nkg2a的nk细胞的方法和应用。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(natural?killer?cells，nk)是人体天然免疫细胞中的重要组分，nk细胞可以通过表面tcr和相关的cd3分子的缺失，以及cd56的表达来鉴定，在防御疾病包括恶性肿瘤第一防线中能发挥重要作用。与获得性免疫系统的细胞(例如t细胞)相比，nk细胞无需预先刺激或致敏即可启动细胞毒活性，从而提供即时的自然反应。nk细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素又可通过fas配基。nk细胞可以产生tnf-α、ifn-γ和il-1，这些细胞因子在nk细胞抗癌反应以及调动t淋巴细胞中有十分重要地位。由于nk细胞具有快速的杀伤作用和广泛的靶细胞，提示nk细胞可以用于治疗恶性肿瘤。研究证明，过继转输体外活化、扩增自体或同种异体nk细胞对治疗多种白血病和实体瘤有效。

2、nk细胞用于肿瘤治疗是通过体外制备对肿瘤具有杀伤功能的nk细胞，然后回输给患者，在患者体内试验对肿瘤细胞的杀伤，达到治疗效果?；竦米愎皇康?、杀伤性强、质量稳定的nk细胞，是实现nk细胞临床应用的关键。但是由于来源于外周血的nk细胞难易在体外大量扩增，而且从外周血分离纯化nk细胞有一定的技术难度，难易避免t淋巴细胞的污染，无法获取大量均一的nk细胞并达到临床所需的标准，故nk细胞还不能广泛应用于临床；另外，在有些病例中，nk细胞介导的抗肿瘤反应弱，可能与nk细胞杀伤能力、在体内存活能力差或向肿瘤部位迁移受限等因素有关。

3、nkg2a是一种细胞表面分子，存在于nk细胞和t细胞(特别是cd8+t细胞)。nk细胞中nkg2a与cd94形成异源二聚体，配体结合以后激活nkg2a，激活细胞内的抑制性信号通路，抑制来自激活型受体的激活信号，最终抑制nk细胞的活性。nkg2a可以与人体的hla-e蛋白结合(小鼠中相应得蛋白为qa-1)，进而产生免疫抑制信号，抑制nk细胞和cd8+t细胞的功能。癌细胞也会表达hla－e甚至会大量表达hla－e，这样就会产生免疫抑制。研究发现，将小鼠肿瘤细胞的qa-1敲除，可以明显降低肿瘤的生长速度和肿瘤大小，nkg2a与qa-1结合可以抑制nk细胞的抗肿瘤能力。

4、基因编辑技术是研究功能基因组的重要技术手段，目前已经发展了四代基因编辑技术：大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、crispr等。通过基因编辑技术，对nk细胞进行改造，以进一步提高其抗肿瘤功能是当下的研究热点，但原代nk细胞难以达到高效率的基因编辑，使其成为当下的研究难点。2013年以来，crispr-cas系统迅速崛起，发展成为各大领域主要的基因组定点编辑的新工具。其中应用最广发的是spcas9，与之相比新开发的ascas12a具有多重优势，如编辑特异性高，且crrnas较短，更适合人工合成，而其最大缺陷是编辑效率。最新版本的ascas12a?ultra克服了ascas12a的缺陷，在多种具有临床应用价值的细胞如造血干/祖细胞(hspcs)、ipscs、t细胞以及nk细胞中，其基因敲除效率接近100％，且基因编辑特异性也依然维持在高水平。

技术实现思路

1、本发明为了解决目前使用滋养细胞培养起来的nk细胞在临床应用方面存在安全性隐患；无滋养细胞培养有效扩增倍数低或操作复杂等问题，提供了用于靶向敲除nkg2a基因的sgrna及制备敲除nkg2a的nk细胞的方法和应用，通过靶向敲除nkg2a基因获得不表达nkg2a的nk细胞，以提高nk细胞的抗肿瘤功能，使其能开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂，为过继免疫治疗肿瘤及病毒感染性疾病提供新的生物制剂。

2、本发明由如下技术方案实现的：用于靶向敲除nkg2a基因的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no.1或seq?id?no.2所示。

3、进一步的，所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、利用所述sgrna制备敲除nkg2a的nk细胞的方法，利用crispr/cas12a?ultra基因编辑系统，所述sgrna和crispr?cas12a?ultra蛋白共孵育，将所述sgrna和cas12a?ultra蛋白的复合物通过电穿孔转染方式导入待改造的经扩增的nk细胞中，培养2-3天；其中sgrna与cas12a?ultra蛋白的摩尔比为1：0.5-2。

5、本发明还提供了利用所述方法获得的敲除nkg2a的nk细胞。

6、本发明还提供了所述的用于靶向敲除nkg2a基因的sgrna在制备用于治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的应用。

7、本发明还提供了所述的敲除nkg2a的nk细胞在制备用于治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物或在制备用于治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。

8、本发明可通过从pbmc直接扩增培养的因子刺激的无滋养细胞扩增体系通过电转染进行编辑。采用本发明所述seq?no.1的sgrna对nk细胞中nkg2a的敲除效率为69.1％。采用本发明所述seq?no.2的sgrna对nk细胞中nkg2a的敲除效率为65.1％，对nk细胞中nkg2a的敲除后，显著提高nk细胞的体外扩增能力。对肿瘤细胞的杀伤能力显著提升，对肺癌细胞nci-h358的杀伤效率为76％，明显高于nk细胞的杀伤效率42％。

技术特征：

1.用于靶向敲除nkg2a基因的sgrna，其特征在于：所述sgrna的核苷酸序列如seq?idno.1或seq?id?no.2所示。

2.根据权利要求1所述的用于靶向敲除nkg2a基因的sgrna，其特征在于：所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

3.利用权利要求1或权利要求2所述sgrna制备敲除nkg2a的nk细胞的方法，其特征在于：利用crispr/cas12a?ultra基因编辑系统，所述sgrna和crispr?cas12a?ultra蛋白共孵育，将所述sgrna和cas12a?ultra蛋白的复合物通过电穿孔转染方式导入待改造的经扩增的nk细胞中，培养2-3天；其中sgrna与cas12a?ultra蛋白的摩尔比为1：0.5-2。

4.利用权利要求3所述方法获得的敲除nkg2a的nk细胞。

5.如权利要求1或2所述的用于靶向敲除nkg2a基因的sgrna在制备用于治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的应用。

6.如权利要求4所述的敲除nkg2a的nk细胞在制备用于治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物或在制备用于治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，为了解决目前使用滋养细胞培养起来的NK细胞在临床应用方面存在安全性隐患；无滋养细胞培养有效扩增倍数低或操作复杂等问题，提供了用于靶向敲除NKG2A基因的sgRNA及制备敲除NKG2A的NK细胞的方法和应用，sgRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。通过靶向敲除NKG2A基因获得不表达NKG2A的NK细胞，提高NK细胞的抗肿瘤功能，使其能开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂，为过继免疫治疗肿瘤及病毒感染性疾病提供新的生物制剂。NKG2A敲除后，显著提高NK细胞的体外扩增能力。显著提升对肿瘤细胞的杀伤能力，对肺癌细胞NCI?H358的杀伤率为76％。

技术研发人员：卢社莲,唐立春,李营营,全壮
受?；さ募际跏褂谜撸?/b>北京鼎成肽源生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29