一种重组人源纤连蛋白的制备与应用的制作方法

本发明涉及一种重组人源纤连蛋白的制备与应用，属于基因工程。

背景技术：

1、连蛋白(fibronectin，fn)是高分子量糖蛋白，含糖4.5％-9.5％，是一种多功能的糖蛋白，在血浆中含量丰富，广泛分布于细胞外基质中，主要功能是介导细胞粘着。纤连蛋白(fn)是一种分子量约为440000道尔顿的大糖蛋白，由2个分子质量为220000道尔顿的亚基通过二硫键连接而成的二聚体，整个分子形状是由两条相似的a链及b链组成，呈v形。每个fn亚单位上有多种物质的结合域与功能密切相关：2个肝素结合域；3个血纤维蛋白结合域；1个胶原蛋白结合域，fn上的胶原蛋白结合域与细胞基质中的胶原结合，从而将细胞吸附于细胞外基质上；1～2个真核细胞结合域在fn?iii?10，而第二位于fn?iii?9，纤连蛋白通过纤连蛋白fn?iii?10和fn?iii?9上的精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸序列(arg-gly-asp,rgd)识别整合素异二聚体并与之结合，进而影响细胞黏附、迁移等。纯化的纤连蛋白可增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连细胞的黏附与迁移是细胞与细胞外基质进行特异性识别、结合与作用的结果。细胞外基质蛋白质分子与细胞膜相应的受体整合素之间的相互作用，是决定细胞黏附与迁移的重要机制。其中配体分子纤连蛋白与相应的整合素之间的相互作用，是细胞黏附与迁移调节的中心环节，fn可以将细胞连接到细胞外基质上。

2、纤连蛋白具有多种粘附功能，例如细胞间粘附，纤连蛋白在伤口愈合中也很重要。沉积在受损胶原蛋白和纤维蛋白上的可溶性纤连蛋白会增强血小板附着，吞噬细胞和成纤维细胞迁移以及细胞增殖。除了粘附，纤连蛋白还可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。在胚胎发生过程中，纤连蛋白对于许多类型细胞的迁移和分化是必需的。在创伤修复中，纤连蛋白亦是重要的。在血凝块形成过程中，纤连蛋白促进血小板附着于血管受损部位。因此，纤连蛋白在医学、美容、护肤领域有广泛的应用前景。

3、虽然动物组织、血液中含有纤连蛋白，但是含量极为有限，且动物提取的蛋白是全长蛋白，皮肤的透过性很差，造成组织来源的纤连蛋白存在产量低、成本高、产品纯度低、透皮率低的缺点。天然提取的纤连蛋白，分子量大，且不均一，提取的蛋白纯品含量有限，且难以形成大规模的生产规模。经动物提取的产品则有产品纯度低、具有携带病毒的风险、免疫原性的风险、成本高等局限性。因此，通过基因工程技术在原核微生物或真核微生物中表达、制备高纯度的人源化纤连蛋白则是必要的。

4、现有的纤连蛋白来源序列并非完全人源，在应用场景中，可能存在免疫原性的问题，其应用场景受限；就生产工艺而言，存在着发酵工艺产量低，发酵菌株易质粒丢失等问题；存在着纯化工艺繁琐，纯度低，纯化收率低等问题，进而不利于大规模的生产纯化等应用。目前已经陆续对进行重组人源纤连蛋白开发工作，但存在这一系列问题，比如，产量较低，无法形成较大的规?；?；纯度较低，生产规?；哂幸欢ǖ陌踩缦?；活性较低，规?；某杀靖?；稳定性差，规?；杀靖?，且不利于产品使用，应用场景简单；此外，现有生产的重组纤连蛋白分子量相对都比较大，其亲水性较强，不易透过皮肤，难以发挥其功能。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种重组纤连蛋白的制备与应用，目的在于解决有的纤连蛋白来源序列并非完全人源，在应用场景中，可能存在免疫原性的问题，其应用场景受限；就分子量而言，存在不易透过等问题，就生产工艺而言，存在着发酵工艺产量低，发酵菌株易质粒丢失等问题；存在着纯化工艺繁琐，纯度低，纯化收率低，稳定性低等问题，进而不利于大规模的生产纯化等应用的技术问题。

2、本发明提供的第一个技术方案为一种重组人源纤连蛋白，氨基酸序列如seq?idno.1所示。

3、本发明提供的第二个技术方案为编码第一个技术方案所述蛋白的基因。

4、在某些实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.2～4任一个所示。

5、本发明提供的第三个技术方案是携带第二个技术方案所述基因的重组质粒。

6、在某些实施方式中，以pet32a(+)或pet28a(+)为表达载体。

7、本发明提供的第四个技术方案是基因工程菌，所述基因工程菌为表达有第一个技术方案所述蛋白，或含有第二个技术方案所述的基因，或转化有第三个技术方案所述质粒的宿主细胞。

8、在某些实施方式中，所述宿主细胞包含原核或真核微生物。

9、在某些实施方式中，所述宿主细胞以大肠杆菌为出发菌株，优选的，以e.colibl21(de3)为表达宿主。

10、本发明提供的第五个技术方案为一种重组纤连蛋白的制备方法，所述方法为培养第四个技术方案所述的基因工程菌，并诱导其表达重组纤连蛋白，破碎菌体，获得重组纤连蛋白粗品。

11、在某些实施方式中，所述基因工程菌接种在tb液体培养基中，于37℃，220rpm培养4-6h，添加0.1～1m的iptg，于25-37℃，220rpm诱导6-8h，离心去上清，超声破碎菌体，离心收集上清得到粗品。

12、在某些实施方式中，对所述重组纤连蛋白粗品进行纯化处理获得重组纤连蛋纯品。

13、进一步，所述纯化处理包括如下步骤：重组纤连蛋白粗品通过镍柱亲和层析分离获得重组纤连蛋纯品。

14、本发明提供的第六个技术方案为第一个技术方案所述的蛋白，或第二个技术方案所述的基因，或第三个技术方案所述的质粒，或者第四个技术方案所述的基因工程菌，或第五个技术方案所述的方法在制备含有纤连蛋白的产品中的应用。

15、本发明提供的第七个技术方案为用于检测纤连蛋白活性的方法，所述方法添加了待检测纤连蛋白样品的1640培养基培养小鼠成纤维细胞nih?3t3，60h后更换为含10％cck8的1640培养基培养2小时，于450nm处检测吸光值；

16、或者所述方法为以添加了待检测纤连蛋白样品的dmem培养基培养人角质形成细胞hacat，24h后更换为含0.5mg/ml?mtt的dmem培养基培养4小时，弃上清dmso于570nm处检测吸光值。

17、相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

18、本发明所选取的人源纤连蛋白序列，通过组合优化后，得到原始的氨基酸序列，将原始氨基酸序列通过密码子优化，使其可以在微生物中异源表达，同时选取了部分标签作为重组纤连蛋白的辅助蛋白，构建融合蛋白，将融合蛋白构建到蛋白表达载体上，转化至微生物体内；并对发酵菌种的表达优化，得到具有高产量纤连蛋白的微生物菌种；菌种通过破碎处理，经过柱层析，酶切等方式，得到重组人源纤连蛋白；其活性蛋白活性，通过类药典法检测，具有低浓度下高活性的特征。本发明得到纯度较高，产量较好的重组人纤连蛋白，重组表达的人纤连蛋白在细胞增殖，黏附，分化方面仍保留高效的生物学活性，在化妆品，医疗器械等方面具有较好的应用前景。

技术特征：

1.一种重组人源纤连蛋白，其特征在于，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。

4.基因工程菌，所述基因工程菌为表达有权利要求1所述纤连蛋白，或含有权利要求2所述的基因，或转化有权利要求3所述质粒的宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞包含原核或真核微生物。

6.一种重组人源纤连蛋白的制备方法，所述方法为培养权利要求4所述的基因工程菌，并诱导其表达重组纤连蛋白，破碎菌体，获得重组纤连蛋白粗品。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌接种在液体培养基中，于37℃，220rpm培养4-6h，添加0.1～1m的iptg，于25-37℃，220rpm诱导6-8h，离心去上清，超声破碎菌体，离心收集上清得到粗品。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所述重组纤连蛋白粗品进行纯化处理获得重组纤连蛋纯品。

9.权利要求1所述的蛋白，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的质粒，或权利要求4或5所述的基因工程菌，或权利要求6～8任一项所述的方法在制备含有纤连蛋白的产品中的应用。

10.用于检测纤连蛋白活性的方法，其特征在于，所述方法为以添加了待检测纤连蛋白样品的1640培养基培养小鼠成纤维细胞nih?3t3，60h后更换为含10％cck8的1640培养基培养2小时，于450nm处检测吸光值；

技术总结
本发明公开了一种重组人源纤连蛋白的制备方法，属于基因工程技术领域，本发明所制备的重组人纤连蛋白通过调节序列的组成，将纤连蛋白的核心片段进行合理组合，去除非必要或者一些对结构具有较大影响的结构域，通过合理优化，得到纯度较高，产量较好的重组人纤连蛋白，重组表达的人纤连蛋白在细胞增殖，黏附，分化方面仍保留高效的生物学活性，在化妆品，医疗器械等方面具有较好的应用前景。

技术研发人员：金成东,王文洁,张加慧,陈依唐,范杰,包康娜,李贝贝
受?；さ募际跏褂谜撸?/b>杭州三言生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6