一种利用南极磷虾制备转谷氨酰胺酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及转移酶，尤其是一种利用南极磷虾制备转谷氨酰胺酶的方法。
【背景技术】
[0002]转谷氨酰胺酶是一种广泛存在于动物组织和人体液体内的一类酶，它可以催化蛋白质分子之间，多肽及各种伯胺之间的共价交联聚合，它与血液凝固、伤口愈合、表皮角质化、红细胞膜硬化等多种生物现象有关。近年来，转谷氨酰胺酶已经引起了广大技术人员的兴趣，其在食品行业、酶的固定化和纺织工业有很大的应用潜力。
[0003]目前，转谷氨酰胺酶的提取方法主要有从动植物组织中提取和由微生物发酵法生产。其中，由微生物发酵法生产最为广泛，但是条件难控制，且由微生物发酵法生产的转谷氨酰胺酶无法达到从动植物组织中提取的生物活性的强度。现有技术中有从豚鼠和鱼组织中制备转谷氨酰胺酶的，但其研究仍处于初级阶段。
[0004]南极磷虾的营养丰富，是高蛋白质食物。到目前为止，还没有发现从南极磷虾中制备转谷氨酰胺酶的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种制备方法合理、制备速度快、操作简单、得物纯度高的利用南极磷虾制备转谷氨酰胺酶的方法。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案为:一种利用南极磷虾制备转谷氨酰胺酶的方法，其特征在于:其经过下列工艺步骤:
(1)原料处理:选取南极磷虾为原料，用清水洗净，切碎，加入缓冲液，进行匀浆，离心，收集清液；其中，所述的缓冲液与南极磷虾的比例为1: 2?3(m/v);
(2)过滤:将步骤(1)中得到的清液采用醋酸纤维膜过滤，收集滤液；
(3)透析:将步骤(2)中得到的滤液采用醋酸钠透析液进行透析，其中，滤液与醋酸钠透析液体积比为1:20?30，4°C透析过夜，得南极磷虾蛋白质粗提液；
(4)超滤:将步骤(3)中得到的南极磷虾粗提液采用分子截留量为10000道尔顿的超滤设备进行超滤分离，截留包括小分子蛋白质在内的杂质，得南极磷虾蛋白质滤过液；
(5)离子交换层析纯化:将步骤(4)中得到的南极磷虾蛋白质滤过液采用强阳离子交换树脂进行离子交换层析，采用洗脱液洗脱，收集吸收峰，得转谷氨酰胺酶纯化液；
(6)超滤浓缩:将步骤(5)中得到的转谷氨酰胺酶纯化液经过分子截留量为10000道尔顿的超滤设备进行超滤浓缩，得转谷氨酰胺酶浓缩液；
(7)冷冻干燥:将步骤￠)中得到的转谷氨酰胺酶浓缩液用80?90%乙醇沉降，离心，收集沉淀；将沉淀冷冻干燥，得纯化的转谷氨酰胺酶。
[0007]所述的匀浆是将加入缓冲液的南极磷虾送入匀浆机，控制转速4000?6000r/min，勾楽 10 ?30min。
[0008]所述的离心是将勾楽后的南极磷?!下送入离心机，控制转速6000?8000r/min，离心 10 ?15min。
[0009]所述的缓冲液是将8mM NaCl与15mM Tris-HCl溶于1000ml去离子水中制成。
[0010]所述的醋酸钠透析液是将20mM醋酸钠、45mM NaCl、2mM EDTA与0.5mM DTT溶于1000ml去离子水中，调节pH值为6.5制成。
[0011 ]所述洗脱液是 0.2mol/L 的 Tris-HCl。
[0012]本发明对清洗过的南极磷虾切碎加入缓冲液进行匀浆，离心，取清液用醋酸纤维膜过滤去除上层浊液，得到的滤液用醋酸钠透析液对其进行透析，再采用超滤设备进行超滤，滤过液经过离子交换树脂层析纯化后，将得到的纯化液超滤浓缩，冷冻干燥，即得纯化的转谷氨酰胺酶。本发明在制备过程中采用醋酸纤维膜过滤，能够保证吸附量最低，不会吸附目的蛋白；采用了离子交换层析，灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快；采用了两次超滤，既能使样品得到浓缩，又能去除杂质。本发明的利用南极磷虾制备转谷氨酰胺酶的方法，其制备工艺合理，操作简单，制备速度快，提取得到的转谷氨酰胺酶纯度较高，经测定，其酶活回收率为75?85%。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0014]实施例1
一种利用南极磷虾制备转谷氨酰胺酶的方法，其经过下列工艺步骤:
(1)原料处理:选取南极磷虾为原料，用清水洗净，切碎，加入缓冲液，送入到匀浆机中，控制转速6000r/min，勾楽20min ;勾楽后的南极磷4下送入离心机，控制转速8000r/min，离心lOmin ;去除杂质，收集清液；其中，缓冲液是将8mM NaCl与15mM Tris-HCl溶于1000ml去离子水中制备而成，缓冲液与南极磷虾的比例为1: 2.5(m/v);
(2)过滤:将步骤(1)中得到的清液采用醋酸纤维膜过滤，去除上层浊液，收集滤液；
(3)透析:将步骤(2)中得到的滤液采用醋酸钠透析液进行透析，其中，醋酸钠透析液是将20mM醋酸钠、45mM NaCl、2mM EDTA与0.5mM DTT溶于1000ml去离子水中，调节pH值为6.5制备而成；滤液与醋酸钠透析液体积比为1:25，4°C透析过夜，得南极磷虾蛋白质粗提液；
(4)超滤:将步骤(3)中得到的南极磷虾粗提液采用分子截留量为10000道尔顿的超滤设备进行超滤分离，截留包括小分子蛋白质在内的杂质，得南极磷虾蛋白质滤过液；
(5)离子交换层析纯化:将步骤(4)中得到的南极磷虾蛋白质滤过液采用GE公司的强阳离子交换树脂进行离子交换层析，利用0.2mol/L的Tris-HCl作为洗脱液进行洗脱，收集吸收峰，得转谷氨酰胺酶纯化液；
(6)超滤浓缩:将步骤(5)中得到的转谷氨酰胺酶纯化液经过分子截留量为10000道尔顿的超滤设备进行超滤浓缩，得转谷氨酰胺酶浓缩液；
(7)冷冻干燥:将步骤￠)中得到的转谷氨酰胺酶浓缩液用85%乙醇沉降，离心，收集沉淀；将沉淀冷冻干燥，得纯化的转谷氨酰胺酶。
[0015]本实施例所提供的利用南极磷虾制备转谷氨酰胺酶的方法，其工艺合理，操作简单，分离纯化速度快，提取得到的转谷氨酰胺酶纯度较高。经测定，其酶活回收率为82.5%。
[0016]实施例2 一种利用南极磷虾制备转谷氨酰胺酶的方法，其经过下列工艺步骤:
(1)原料处理:选取南极磷虾为原料，用清水洗净，切碎，加入缓冲液，送入到匀浆机中，控制转速5000r/min，勾楽lOmin ;勾楽后的南极磷好送入离心机，控制转速7000r/min，离心12min ;去除杂质，收集清液；其中，缓冲液是将8mM NaCl与15m