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专利名称：?；酋０被〈亩啻渭谆玖献魑馊玖虾?或标记物的用途的制作方法
近年来，开发出了越来越灵敏和易于操作的检测方法，这些方法尤其是用于仅有少量物质供分析的生物技术中。在此，例如荧光检测方法的用途广泛增加。荧光染料被用作标记物来标记生物物质如蛋白质、DNA、RNA、碳水化合物、脂肪或整个细胞。但是，由于许多被标记物质本身在400-500nm具有荧光性质，因此所用标记染料应该在超过500nm、通常在500至1200nm的波长处吸收。此外，在该波长区域中，可以提供廉价的激光二极管作为光源。
现有技术已知的荧光染料经常是被亲水或酸性基团取代，以确保在水中、在中性或略呈碱性pH条件下的溶解度。这使得主要在含水基质中操作的生物材料标记更容易。此外，染料应该是光稳定的，以使其甚至可用于包括较长辐射的测量方法。但是，许多染料在较长波长处的吸收不具有足够的光稳定性。
染料与生物样品共价结合或通过吸收结合在生物样品上。例如，蛋白质的巯基和游离氨基是使染料分子共价偶合的活性基团。此外，亲水或亲脂染料可以通过吸收与蛋白质的亲水或疏水区域结合。离子型染料还可以通过离子的相互反应吸收到蛋白质上。
迄今花青染料(Waggoner等，Bioconjugate Chemistry，4，105-111(1993)，US 5,268,486，WO 97/13810)已经频繁地用于趋于形成聚集体的生物分析。除了单体之外，根据染料的化学环境(例如pH)，可以形成H-聚集体和J-聚集体。这被开发用于照相术，因为与单体的吸收相比，聚集体的吸收向蓝移或者红移。然而对于生物标记，这种聚集效应是不希望的，因为如此也会产生一个或多个额外的吸收带。
如果用不同染料标记的样品在不同的波长被激发，则经常需要进行多重分析。为了获得令人满意的激发与发射信号分离，染料共轭物的吸收一定不能重叠。如此，染料的峰形、可复写性和不依赖于pH和溶解的吸收是重要的。频繁使用的花青染料形成聚集体的趋势还因淬火降低了荧光的强度。发射射线或者被直接吸收，或者无辐射能量损失。
现有技术已知的用于生物标记的染料，即花青染料，属于多次甲基染料。此外，WO 97/40104公开了例如方形酸衍生物作为生物标记染料。
本发明的目的是提供作为荧光标记物的、或与现有技术已知花青染料相比具有改进性质的染色用新的荧光染料。尤其是，在生物缓冲系统中的溶解度和光稳定性得到改善，并且尤其减少了形成聚集体的趋势。然而，与此同时，本发明化合物还具有高量子产率和较高的消光系数。
本发明提供了多次甲基染料，其含有至少一个式(I)?；酋０被?其中n表示1、2、3、4、5、6、7、8或9，Y、A表示吸电子基团，优选C＝O或-SO2-，并且R表示任选被取代的烷基或芳基，并且包含至少一种下式化合物(a) (b)-(CH2)nNCS， -(CH2)nNCO， 或 本发明还提供了含有至少一个式(I)?；酋０被亩啻渭谆玖显谌旧?或生物分子标记中的用途。
本发明的多次甲基染料不仅仅用于染色，也通过形成共价键用于生物标记，除了式(I)基团之外，本发明的多次甲基染料还具有至少一个能形成该共价键的基团；按照本发明，该基团优选为(a)(b)-(CH2)nNCS，-(CH2)nNCO， 或
因此，本发明还提供了含有至少一个式(I)?；酋０被椭辽僖桓瞿苄纬晒布奂难∽韵铝谢衔锏幕诺亩啻渭谆玖贤ü布劢岷媳昙巧锓肿拥挠猛?a)(b)-(CH2)nNCS，-(CH2)nNCO， 或 对于本发明的应用目的，生物分子应该理解为是指蛋白质以及DNA和/或RNA。此外，对于本发明的应用目的，细胞也可以考虑作为生物分子?；拱ň哂猩镒饔玫男〉挠谢肿?。
除了式(I)化合物之外、还具有选自式(a)至(n)之一基团的多次甲基染料迄今是现有技术中未知的，因此是新化合物。由于能够形成共价键，它们尤其适用于生物标记。
对于本发明的应用目的，除非另外指明，吸电子基团优选应该理解为是指如在March，Advanced Organic Chemistry，3rd Ed.，S.17和S.238中所述的基团。
对于本发明的应用目的，除非另外指明，烷基应该理解为是指直链或支链、环状或链状、取代或未取代的烃。烷基尤其是具有1-12个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、新戊基和2-乙基己基。当然，这些基团可以进一步被取代，特别优选的是被羧基羰基取代。
对于本发明的应用目的，除非另外指明，芳基应该理解为是指芳族烃基，优选5-或6-元环系，可以是单环或稠环系。它们可以是取代或未取代的环系。尤其优选的是例如苯基和萘基。
当本发明染料用于生物系统例如蛋白质共轭物或生物缓冲介质中时，出人意料地发现，与US 5,268,486、WO 96/00902、WO 97/13810和WO 97/40104中所述的具有烷基磺酸基或烷基羧酸基的花青或方形酸染料相比，本发明多次甲基染料的聚集趋势能够减少。
本发明所用染料的另一优点是多次甲基染料的发色性质不因取代基而改变。迄今为止，例如，通过向作为发色团一部分的芳基系统中引入磺基，已经实现了改善花青染料溶解度的官能化。由于取代基具有吸电子作用，还产生了光谱性质的迁移。未取代?；ㄇ嗳玖系墓馄仔灾室延忻枋?，并且因此可以例如通过引入?；撬峄蛊渲苯佑糜谏锓治?。因此可以使花费的时间最佳化并用于筛选实验。
再者，与烷基羧酸基相比，具有?；酋０被娜玖暇哂懈呦庀凳?。这就使得当染料用作标记物时具有进一步的优点。
如果该染料作为标记物与例如蛋白质或抗体共价结合，则共轭物的特征在于染料/蛋白质含量的摩尔比。为了得到令人满意的信号，必须有一定量的染料与蛋白质结合。染料的消光系数越高并且因此其强度越高，染料作为荧光标记物的灵敏度就越高，因为在吸收＜0.05时荧光强度是消光系数的函数。
F＝φKloεcdφ＝量子产率Io＝照射样品的光强度ε＝消光系数c＝样品浓度d＝路径长度但是，由于在其空间紧密时染料淬火，因此染料/蛋白质的比例不应太高。这就导致荧光强度损失。因此，具有高消光系数的染料尤其适于用作荧光标记物。甚至少量的染料即可以以低染料/蛋白质含量摩尔比提供强荧光信号。而且，使淬火过程最小化。
适合本发明使用的多次甲基染料尤其是在下文的优选实施方案中更详细描述的花青染料、部花青、rhodacyanines、苯乙烯染料、方形酸染料和巴豆酸染料，它们的特征在于对于本发明的应用，它们具有至少一个式(I)的取代基。在另一具体实施方案中，式(1)至(5)的多次甲基染料还可以彼此相连，这就使得两种或多种相同或不同的染料可以彼此相连。优选的本发明多次甲基染料是下式所示的那些，除了式(I)的取代基之外，它们还含有至少一个选自下列化合物基团的取代基(a)(b)-(CH2)nNCS，-(CH2)nNCO， 或 1.花青染料根据本发明，合适的花青染料尤其是式1a、1b和/或1c所示的那些 式1-a其中Ra10至Ra110彼此独立地可以表示任何取代基，n表示0、1、2、3或4，Ya11、Ya12和Ya13彼此独立地可以表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，并且Aa11和Ba11彼此独立地表示O、S、Se、Te、N-Ra111、C(Ra112)(Ra113)或-C(Ra114)＝C(Ra115)-，其中Ra11至Ra115彼此独立地可以表示H、具有最多20个碳原子的任选被取代的烷基、任选被取代的芳基或任选被取代的链烯基，条件是，取代基Ra10至Ra115中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
特别优选的用于本发明的式1a化合物如下所列。优选的式1a化合物 式1-b其中Rb10至Rb110彼此独立地可以表示任何取代基，m表示0、1、2、3或4，并且Yb11、Yb12和Yb13彼此独立地可以表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，条件是，取代基Rb11至Rb110中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，下列取代基形成也可任选稠合的5-或6元碳环或杂环取代基Rb11与Rb12和/或Rb14，取代基Rb12与Rb13和/或Rb11，取代基Rb14与Rb15和/或Rb11，取代基Rb18与Rb19和/或Rb17，取代基Rb17与Rb16和/或Rb18，取代基Rb19与Rb110和/或Rb18。特别优选的式1b化合物 式1-c其中Rc11至Rc110彼此独立地可以表示任何取代基，m表示0、1、2、3或4，Yc11，Yc12和Yc13彼此独立地可以表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，并且Bc11表示O、S、Se、Te、N-Rc111、C(Rc112)(Rc113)或-C(Rc114)＝C(Rc115)-，其中Rc11至Rc115彼此独立地表示H、具有最多20个碳原子的任选被取代的烷基、任选被取代的芳基或任选被取代的链烯基，条件是，取代基Rc10至Rc115中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，下列取代基形成也可任选稠合的5-或6元碳环或杂环取代基Rc11与Rc12和/或Rc14，取代基Rc12与Rc13和/或Rc11，取代基Rc14与Rc15和/或Rc11。
取代基Rc17至Rc110可以优选形成可以含有最多4个环、并且可任选带有多个取代基的碳环或杂环系的剩余原子。Rc18与Rc19可以形成π键，并且Rc17和Rc110可以表示取代基。特别优选的式1c化合物 2.部花青特别适用于本发明目的的是式2a和/或2b的部花青 式2a其中Ra21至Ra25彼此独立地表示任何取代基，Ya21、Ya22、Ya23、Ya24彼此独立地可以表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，m表示0、1、2、3、4，o表示0、1、2，Fa21和Ca21彼此独立地表示C＝O、C＝S或C(Ra27)＝，Ba21和Da21彼此独立地表示任选被取代的C、N、O或S，Ra26表示O、S或另一任选被取代的5-或6-元杂环，k、i和j彼此独立地表示0或1，Ra27表示H或任选被取代的烷基或芳基，Aa21表示O、S、Se、Te、N-Ra28、C(Ra29)(Ra210)、-C(Ra211)＝C(Ra212)-，其中Ra28至Ra212表示H或具有最多20个碳原子的任选被取代的烷基、芳基或链烯基，条件是，取代基Ra21至Ra25或Ra27至Ra212中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
取代基Ra22至Ra25优选形成可以含有最多4个环、并且可任选带有多个取代基的碳环或杂环系的剩余原子。Ra22与Ra25一起可以形成π键，并且Ra23和Ra24可以表示取代基。特别优选的式2a化合物 式2-b其中Rb21至Rb25彼此独立地表示任何取代基，Yb21、Yb22、Yb23、Yb24彼此独立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，m表示0、1、2、3或4，o表示0、1、2、3或4，Fb21和Cb21彼此独立地表示C＝O、C＝S或C(Rb27)＝，Bb21和Db21彼此独立地表示任选被取代的C、N、O或S，Rb26表示O、S或另一任选被取代的5-或6-元杂环，k、i和j彼此独立地表示0或1，Rb27表示H或任选被取代的烷基或芳基，下列取代基可以优选形成也可任选稠合的5-或6元碳环或杂环取代基Rb23与Rb24和/或Rb22，取代基Rb22与Rb21和/或Rb23，取代基Rb24与Rb25和/或Rb23。Ab21表示O、S、Se、Te、N-Rb28、C(Rb29)(Rb210)、-C(Rb211)＝C(Rb212)-，Rb28至Rb212可以表示H或具有最多20个碳原子的任选被取代的烷基或任选被取代的芳基或任选被取代的链烯基，或下列取代基之一，条件是，取代基Rb21至Rb25或Rb27至Rb212中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。特别优选的式2b化合物 Rhodacyanines对于本发明的目的，所用rhodacyanines尤其是式3a和/或3b化合物。 式3-a其中Ra31至Ra311彼此独立地表示任何取代基，Ya31、Ya32、Ya33、Ya34、Ya35彼此独立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，p和r彼此独立地表示0、1或2，Qa31表示O；N(Ra312)、S或Se，Aa31、Ba3彼此独立地表示O、S、Se、Te、N-Ra313、C(Ra314)(Ra315)或-C(Ra316)＝C(Ra317)-，其中Ra312至Ra317表示H、具有最多20个碳原子的任选被取代的烷基、芳基或链烯基、或任何取代基，条件是，取代基Ra31至Ra317中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，取代基Ra32至Ra35或Ra36至Ra39形成可以含有最多4个环、并且可任选带有多个取代基的碳环或杂环系的剩余原子。Ra32与Ra35或Ra36与Ra39一起可以形成π键，并且Ra33和Ra34或Ra37与Ra38可以表示取代基。特别优选的式3a化合物 式3-b其中Rb31至Rb311彼此独立地表示任何取代基，Yb31、Yb32、Yb33、Yb34、Yb55彼此独立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，p和r彼此独立地表示0、1或2，Qb31表示O；N(Rb312)、S或Se，Ab31、Bb31彼此独立地表示O、S、Se、Te、N-Rb313、C(Rb314)(Rb315)或-C(Rb316)＝C(Rb317)-，其中Rb311至Rb317表示H、具有最多20个碳原子的任选被取代的烷基、芳基或链烯基、或任何取代基，条件是，取代基Rb31至Rb317中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，取代基Rb36至Rb39形成可以含有最多4个环、并且可任选带有多个取代基的碳环或杂环系的剩余原子。Rb36与Rb39一起可以形成π键，并且Ra37与Ra38可以表示取代基。下列取代基可以形成也可任选稠合的5-或6元碳环或杂环取代基Rb33与Rb32和/或Rb34，取代基Rb32与Rb33和/或Rb31，取代基Rb34与Rb35和/或Rb33。特别优选的式3b化合物 苯乙烯基染料特别优选的用于本发明目的的苯乙烯基染料是式4a、4b、4c和/或4d化合物 式4-a其中Ra41至Ra411彼此独立地表示任何取代基，Ya41和Ya42彼此独立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，Aa4表示O、S、Se、Te、N-Ra412、C(Ra413)(Ra414)或-C(Ra415)＝C(Ra416)-，其中Ra412至Ra416表示H、具有最多20个碳原子的任选被取代的烷基、芳基或链烯基、或任何取代基，条件是，取代基Ra41至Ra416中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，取代基Ra48至Ra411形成可以含有最多4个环、并且可任选带有多个取代基的碳环或杂环系的剩余原子。Ra48与Ra411一起可以形成π键，并且Ra49和Ra410可以表示取代基。
下列取代基可以形成也可任选稠合的5-或6元碳环或杂环取代基Ra45与Ra46或Ra45与Ra44，或者Ra46与Ra41，和/或Ra41与Ra42和/或Ra44与Ra43。特别优选的式4a化合物 式4-b其中Rb41至Rb411彼此独立地表示任何取代基，Yb41和Yb42彼此独立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，n表示0、1、2、3、4或5，条件是，取代基Rb41至Rb411中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，下列取代基可形成也任选稠合的5-或6元碳环或杂环取代基Rb45与Rb46和/或Rb45与Rb44，或者Rb46与Rb41，和/或Rb41与Rb42和/或Rb44与Rb43。
取代基Rb49与Rb410和/或Rb48，取代基Rb410与Rb411和/或取代基Rb48与Rb47。特别优选的式4b化合物 式4-c其中Rc41至Rc410彼此独立地表示任何取代基，Yc41和Yc42彼此独立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，Ac41表示O、S、Se、Te、N-Rc411、C(Rc412)(Rc413)或-C(Rc414)＝C(Rc415)-，其中Rc411至Rc416表示H、具有最多20个碳原子的任选被取代的烷基、芳基或链烯基、或任何取代基，并且n表示0、1、2、3、4或5，条件是，取代基Rc41至Rc415中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，下列取代基可以形成也任选稠合的5-或6元碳环或杂环取代基Rc45与Rc46或Rc45与Rc44，或者Rc46与Rc41，和/或Rc41与Rc42和/或Rc44与Rc43。取代基Rc47至Rc410形成可以含有最多4个环、并且可任选带有多个取代基的碳环或杂环系的剩余原子。Rc47与Rc410一起可以形成π键，并且Rc48和Rc49可以表示取代基。特别优选使用的式4c化合物 式4-d其中Rd41至Rd410彼此独立地表示任何取代基，Yd41和Yd42彼此独立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，n可以表示0、1、2、3、4或5，条件是，取代基Rd41至Rd410中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，下列取代基可以形成也任选稠合的5-或6元碳环或杂环取代基Rd45与Rd46和/或Rd45与Rd44，和/或Rd46与Rd41，和/或Rd41与Rd42和/或Rd44与Rd43。
取代基Rd49与Rd410，和/或取代基Rd48与Rd47。特别优选使用的式4d化合物 5.方形酸对于本发明目的，优选使用的方形酸是式5a、5b和/或5c化合物 式5-a其中Ra51至Ra510彼此独立地可以表示任何取代基，Ya51至Ya54彼此独立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，s和t彼此独立地表示0、1、2或3，k表示1或2，Ya52表示O、S或＝NRa511，Ya53表示O-Ra512、S-Ra513或N(Ra514)(Ra515)，其中Ra511至Ra515彼此独立地可以表示任何取代基，Aa51和Ba51彼此独立地表示O，S，Se，Te，N-Ra516，C(Ra517)(Ra518)或-C(Ra519)＝C(Ra520)-，其中Ra516至Ra520表示任何取代基，优选H、具有最多20个碳原子的任选被取代的烷基、芳基或链烯基，条件是，取代基Ra51至Ra520中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，取代基Ra52至Ra55或Ra56至Ra59形成可以含有最多4个环、并且可任选带有多个取代基的碳环或杂环系的剩余原子。Ra52与Ra55和/或Ra56与Ra59一起可以形成π键，并且Ra53和Ra54或Ra57与Ra58可以表示取代基。特别优选的式5a化合物 式5-b其中Rb51至Rb512彼此独立地可以表示任何取代基，Yb51至Yb54彼此独立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，s和t彼此独立地表示0、1、2或3，k表示1或2，Yb52表示O、S或＝NRb513，Yb53表示O-Rb514、S-Rb515或N(Rb516)(Rb517)，其中Rb513至Rb517彼此独立地可以表示任何取代基，条件是，取代基Rb51至Rb517中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，下列取代基可以形成也任选稠合的5-或6元碳环或杂环取代基Rb55与Rb56和/或Rb55与Rb54，和/或Rb56与Rb51，和/或Rb51与Rb52和/或Rb54与Rb53。
取代基Rb59与Rb58或Rb510与Rb511，取代基Rb511与Rb512和/或取代基Rb58与Rb57。特别优选的式5b化合物 式5-c其中Rc51至Rc511彼此独立地可以表示任何取代基，Yc51至Yc54彼此独立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳环或杂环，s和t彼此独立地表示0、1、2或3，k表示1或2，Yc52表示O、S或＝NRc512，Yc53表示O-Rc513、S-Rc514或N(Rc515)(Rc516)，Ac51表示O，S，Se，Te，N-Rc517，C(Rc518)(Rc519)或-C(Rc520)＝C(Rc521)-，其中Rc512至Rc521表示任何取代基，优选H、具有最多20个碳原子的任选被取代的烷基、芳基或链烯基，条件是，取代基Rc51至Rc521中的至少一个选自下列基团-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1-6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
在一个优选的具体实施方案中，下列取代基形成也任选稠合的5-或6元碳环或杂环取代基Rc55与Rc56和/或Rc55与Rc54，和/或Rc56与Rc51，和/或Rc51与Rc52和/或Rc54与Rc53。
取代基Rc57至Rc510优选形成可以含有最多4个环、并且可任选带有多个取代基的碳环或杂环系的剩余原子。Rc58与Rc59一起可以形成π键，并且Rc57与Rc510可以表示取代基。特别优选的式5c化合物
对于本发明的应用目的，取代基应该理解为是指例如卤素、尤其是例如F、Cl或Br，还有烷氧基、烷硫基、芳氧基、芳硫基、酰氨基、烷基磺酰氨基、烷基氨磺?；?、烷基氨基甲?；?、芳基磺酰氨基、芳基氨磺?；?、芳基氨基甲?；?、烷基、链烯基、芳基、杂芳基、亚芳基、杂亚芳基、亚烷基、烷氧羰基、脲基或氰基?；褂叛∪〈臀慈〈幕吠榛约叭〈蛭慈〈姆蓟?，特别是苯基；特别优选的取代基是任选被取代的烷基、芳基、磺基烷基、羧基烷基、-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l表示1至6之间的数，Z表示NH或N-，并且R优选表示任选被取代的烷基或芳基。
对于本发明的目的，链烯基应该理解为是指直链或支链、环状或链状、取代或未取代的不饱和烃基，例如乙烯基、2-丙烯基、异丙烯基。
对于本发明的应用目的，碳环或杂环系应该理解为是指由4、5、6、7或8个碳原子组成的环系，其中最多3个碳原子可以被杂原子例如N、O、SE或S置换。该环系可以是脂族或芳族环；优选的是，2、3或4个相同或不同的环可以以稠合环系存在。对于本发明的应用目的，碳环芳族基团应该理解为是指，优选5-或6-元稠合和/或取代的环系，特别是苯基和萘基。不饱和杂环系应该理解为是指，优选5-或6-元环系，它可以是单环的形式，也可以是稠环系。此处，适合的杂原子尤其是N、S和O?；废涤叛【哂?-3个杂原子，杂原子可以相同或不同。优选的环是呋喃基、吲哚基、噻吩基、吡咯基和咔唑基。这些基团可以是未取代的，或者优选是被取代的。此处，碳环芳族基团和不饱和杂环基可以作为它们的一部分以取代基的形式存在，还可以包括不同环系的稠合。本发明特别优选的式1-5之一的化合物如下所列 按照本发明，染料还可以与抗体共轭，并用于例如流动细胞分析。这些多次甲基染料的一个优点是，它们事实上可以对500至900nm范围内的任何波长量身定作。结果是可以进行多色检测。在流动细胞分析中，例如，在各种情况下，不同的抗体可以用一种荧光染料标记，然后使用合适的检测系统在一个试验中同时检测。然后这种特定的抗体识别出细胞上的不同表位。使用该系统，还可以进行定量分析。因此，每一试验使用多荧光标记抗体得到更高的信息含量。这意味着价格优势，尤其例如对于临床实验。
此外，对通过荧光共振能转移而相互反应的生物分子进行标记还可以进行定性和/或定量检测方法。
本发明还提供了上述染料在标记DNA，RNA或核苷酸类似物如PNA中的用途，由此，它们可用于核酸分析。在此，通常，活性染料分子与核苷酸、核苷、核苷酸类似物或低聚核苷酸或其类似物结合。该结合是通过与活性染料反应的核苷酸或其类似物的亲核基团发生的。常规的亲核基团是氨基、硫羟基、羟基或其他基团?；钚曰磐ǔＪ囚然难苌?，例如N-羟基琥珀酰亚胺酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺或碘乙酰胺衍生物。此外，亲核基团可以与磷酰胺酸酯(phosphoamidite)基反应，在染料分子与生物分子之间形成共价键。
在另一应用中，染料还可以连接到固相例如聚合物珠上，或者结合到其中。聚合物珠可以被官能化，并且作为其一部分用作生物分析的荧光标记物。
如上所述，含有式(I)基团的多次甲基染料是照相术中已知的；它们可以例如按照EP 0534283、EP 0530511、DE 1081311中所述方法获得。
相反，含有式(I)基团、并且同时含有能使其形成共价键的基团的多次甲基染料选自下列化合物(a)(b)-(CH2)nNCS，-(CH2)nNCO， 这些化合物是新的，并且在现有技术中从未描述过。因此，下面将描述获得这些“活化”染料的合成方法制备本发明染料F和J的合成方法1.合成F A将0.15mol 3，4-二羟基-3-环丁烯-1，2-二酮在150mL无水乙醇中加热回流12小时。
浓缩反应混合物。
所得的油状物经柱色谱纯化。
流动相甲基叔丁基醚/异辛烷50∶50
固定相AMICON 35-70 mic。
产率48％ C将0.055mol A、0.0068mol B和0.0078mol三乙胺在50mL无水乙醇中煮沸回流。35分钟后，加入0.107mol三乙胺。3.5小时后，使该混合物冷却。加入乙酸乙酯，并在剧烈搅拌后倾析该混合物。重复这些步骤3次，得到油状物(C)。水解成D将油状物C在0.145mol (C4H9)4NOH(1M甲醇溶液)中加热回流。30分钟后，使该混合物冷却。加入500mL丙酮和16mL浓盐酸。滤出沉淀的固体。产量28g E将0.63mol 2，3，3-三甲基假吲哚和0.5mol Br(CH2)5COOH在少量乙腈中加热回流3小时。反应混合物的温度为130℃。加入0.5mol乙酸，并使该混合物冷却至100℃。然后加入250mL甲乙酮，并将该混合物在冰浴中再冷却至15℃。滤出沉淀的固体，并在50℃干燥。
产率75％ G将3.5mol苯基肼-4-磺酸和1.9L乙酸在105℃加热。30分钟后，滴加4.8mol 3-甲基-2-丁酮。1小时50分钟后，加热除去溶剂，并加入在3.5L甲醇中的4.2mol乙酸钾。该混合物进一步在冰浴中冷却，并滤出沉淀的固体。用乙酸乙酯洗涤。
产率77％ H将26.8mol氯乙酰氯和25.5mol甲磺酰胺在10.2L乙酸丁酯中缓缓煮沸回流。8小时后，使该混合物冷却至20℃。滤出沉淀的固体，并在4L乙酸丁酯中搅拌。沉淀的固体在装有通风机以帮助干燥的橱柜内于50℃干燥。
产率74％ B将2.5mol G和2.5mol H在1.3L环丁砜中、于130℃加热。5小时50分钟后，使该混合物冷却至50℃。加入2.5L丙酮，并将该混合物进一步冷却至室温。滤出沉淀的固体，并用丙酮洗涤。在1.6L温热的去离子水中搅拌该沉淀的固体。加入1.6L乙醇，并使该混合物冷却。滤出沉淀的固体，并用乙醇洗涤。产率53％ F在装有迪安-斯榻克分水器的烧瓶中，将4.7g D、3.5g E和1.4mL三乙胺在正丁醇/甲苯中煮沸回流。2.5小时后，使该混合物冷却。该混合物用水萃取3次。浓缩反应混合物，然后再溶解于乙醇中。加入3g乙酸钾，并将该混合物过滤。将沉淀的固体溶解在水中，加入丙酮。倾析出溶剂，加入更多丙酮。重复这些步骤直至出现沉淀。滤出沉淀的固体。2.合成J I将0.1mol G和0.12mol Br(CH2)5COOH在35mL环丁砜中于130℃加热。3小时后，加入100mL二甲基乙酰胺，并使该混合物冷却至室温。滤出沉淀的固体，并在滤器上用二甲基乙酰胺洗涤。在丙酮中将沉淀的固体煮沸。冷却后，将该混合物过滤，并在装有通风机以帮助干燥的橱柜中、于50℃干燥。产率90％ J将4.7g D和3.5g I在80mL正丁醇/吡啶(7∶1)中煮沸回流2小时10分钟。将该混合物冷却至室温，滤出沉淀的固体。在滤器上，用正丁醇或丙酮洗涤该固体。将滤出的固体溶解在7mL去离子水和30ml乙腈中，并在搅拌下加入乙腈。倾析出液相，并在搅拌下加入更多的乙腈。倾析出液相，并将所得油状物与40mL饱和氯化钠溶液一起搅拌。离心该细分散的悬浮液，并倾析出液相。将沉淀的固体溶解在甲醇中，并滤出氯化钠。浓缩滤液。产物在50℃干燥。产率1.57g(18.5％)由具有羧基官能团的多次甲基染料制备琥珀酰亚氨基酯的一般方法本发明描述了由具有至少一个羧基官能团的多次甲基染料制备琥珀酰亚氨基酯。然后，这些酯可用于标记生物分子如蛋白质、抗体或核酸。
将0.05mmol染料和碳酸二琥珀酰亚氨基酯(1.5当量/羧基)溶解在40mL DMF中，并加入一刮勺尖二甲氨基吡啶。该混合物在40℃搅拌3小时。冷却后，将上清液分成1ml的等份量，装入玻璃小瓶中。减压蒸发溶剂，并在4℃避光贮藏该产物直至使用。
粗产物直接用于标记蛋白质。标记蛋白质的一般方法为了进行标记，将粗产物(1等份)溶解在1ml DMF中。将50μl该溶液吸移至在0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.2)中的1.5mL(＝1mg)抗-HSA溶液中。然后在室温搅拌反应溶液2小时。
然后，使用预先用PBS(pH7.4)平衡好的Sephadex G50柱进行凝胶渗透色谱，从未结合的染料中分离共轭物。用染料标记低聚核苷酸的一般方法本发明染料还可用于标记DNA或RNA核苷酸或核苷酸类似物。 染料K将50mmol活性染料，例如异硫氰酸酯K溶解在50ml DMF或乙腈中。首先将10nmol NH2-低聚核苷酸加至150μl 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.2)中，并用移液管缓缓加入75nmol染料。在25℃和避光条件下搅拌该溶液3-5小时。纯化低聚核苷酸用C8柱通过RP-HPLC从未结合的染料和未标记的DNA中纯化未标记的低聚核苷酸。用线性梯度、例如70％水至100％甲醇洗脱30分钟。
收集在254nm和染料最大吸收处同时吸收的馏分，并减压除去溶剂。
为了进一步使用修饰的低聚核苷酸，可以通过用乙醇沉淀从过量的盐中将其分离。
实施例表1示出了在相似的染料/蛋白质摩尔比时染料的相对量子产率。所用蛋白质是HSA(人血清白蛋白)。
表1
测定染料/蛋白质的摩尔系数用Pierce的BCA方法(文献Bradford，M.M.；Anal.Biochem.(1976)72，248-254)。预先已经制作了抗HSA的校准曲线。
通过吸收光谱测定染料浓度。测定量子产率测定相对于Cy5的量子产率。测定消光系数假定Beer’s定律适用，测定消光系数。用活化染料F标记抗-HSA为了进行标记，将粗产物(1等份)溶解在1ml DMF中。将50μl该溶液移入在碳酸盐缓冲液(pH9.2)中的1.5mL(＝1mg)抗-HSA溶液中。在室温和避光条件下搅拌反应溶液2小时。
使用Sephadex G25柱凝胶渗透色谱，从未结合的染料中分离共轭物。所用的洗脱缓冲液是PBS，pH7.4。
按照类似的方法制备列于表1中的其他染料的蛋白质共轭物。
表1示出了本发明染料比起例如Cy5具有较高的量子产率和消光系数。因此，它们尤其适于用作生物分析的荧光标记物。
与迄今常用的多次甲基染料相比，本发明染料的染料共轭物显示出较低的形成聚集体的趋势。其证据列在表2中。
表2
在单体最大吸收中的吸收强度是单体在溶液中浓度的相对度量，对于聚集体的浓度也是如此?？梢远员绕鸬ヌ逑蚶兑频木奂遄畲笪罩械奈涨慷冉行拚?。
表2示出了单体和聚集体最大吸收的强度比。盐浓度增加导致聚集体形成。与CY5相比，本发明的染料J显示聚集体的形成非常低。方形酸染料如Sq-1至Sq-3在聚集体形成方面具有不稳定的特性，聚集体的形成随着盐浓度的增加而增加。
相反，本发明的染料F和J具有稳定的特性。光稳定性通过将染料溶液暴露在日光下测定光稳定性。溶液的吸收在1.4至1.60.D.之间变化。测量随着时间推移吸收的减少以测定染料的光稳定性。由于染料的处理还包括染料暴露于日光下过程中的手工操作步骤，所以选择这些条件。如果是CY5，这种下降明显清晰可见的，甚至在30分钟后。吸收下降了12％。本发明染料则不出现这种情况，因此后者由于能维持稳定的吸收而对使用者也是更有利的。
权利要求
1.多次甲基染料，含有至少一个式(I)的取代基， 其中n表示1、2、3、4、5、6、7、8或9；Y、A表示吸电子基团，优选C＝O或-SO2-，并且R表示任选被取代的烷基或芳基，并且包括至少一种选自下列的取代基(a) (b)-(CH2)nNCS， -(CH2)nNCO， 或
2.权利要求1的化合物，其特征在于，多次甲基染料是花青染料、部花青、rhodacyanines、苯乙烯染料、方形酸染料和/或巴豆酸染料。
3.权利要求1或2所述的至少一种化合物通过共价结合标记生物分子的用途。
4.至少一种含有式(I)基团的多次甲基染料在生物分子染色中的用途。
5.至少一种下列化合物在标记生物分子中的用途 Naphthole Croconium染料 Naphthole Squaraines
全文摘要
本发明涉及新的多次甲基染料,其中含有至少一个式(I)的?；酋０被椭辽僖恢秩ɡ笫橹兴臼?a)至(n)化合物的基团,在式(I)中,n、Y、A和R的含义如权利要求书中所示。本发明多次甲基染料适于用作染料和/或标记物,尤其是用于生物分子染色或标记。
文档编号C09B23/02GK1369062SQ00811340
公开日2002年9月11日 申请日期2000年7月24日 优先权日1999年8月5日
发明者G·德罗维尔, M·米斯菲尔德特, L·西蒙 申请人:拜尔公司