用于条件性激活免疫细胞的合成受体的制作方法

背景技术：

1、合成免疫受体和表达它们的重组细胞是用于针对诸如癌症和感染性疾病等病状的个性化疗法的令人振奋的技术。所谓的“过继性细胞疗法”包括将靶向选定抗原的合成受体(通常是“嵌合抗原受体”或“car”)引入免疫细胞中，以产生重组免疫细胞(通常称为“car-t”或“car-nk”细胞，取决于所选免疫细胞的类型)。在输注到受试者体内后，重组免疫细胞选择性地靶向病变细胞或病原体。

2、尽管基于car的疗法已展示出前景，特别是在b细胞恶性肿瘤的治疗中，但此类疗法并非没有风险。一个具体的局限是与免疫应答的过度激活相关的毒性(例如，细胞因子释放综合征、神经毒性和过敏反应)。因此，需要新技术来减少与基于car的疗法相关的毒性。限制与car相关的毒性的一种方法是调节与car激活相关的细胞内信号传导动力学。传统的car分子包含cd3-ζ(cd3z)细胞内信号传导结构域，其包含免疫受体酪氨酸激活基序(itam)，从而在抗原与car结合时激活免疫细胞，诸如t细胞或nk细胞。然而，cd3z信号传导的强烈激活可能导致免疫应答的过度激活并产生毒性。免疫细胞的过度激活还可能导致免疫耗竭，其中随着免疫应答的持续，免疫细胞丧失对靶标的活性。

3、一种替代性方法是用在激活时毒性降低的替代性结构域替换cd3z细胞内信号传导结构域。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)是由nk细胞表达的免疫受体。kir可包含itam或免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)以调节免疫细胞的激活。因此，基于kir的合成受体可为传统的基于cd3z的car提供有前景的替代物，以用于在降低毒性并降低耗竭可能性的情况下治疗疾病。另外的方法包括通过将kir结构域或其部分与cd3z结构域或其部分组合以产生重组免疫细胞来细微调整应答。

技术实现思路

1、在各种实施方案中，本文公开了一种激活表达合成受体的重组免疫细胞的方法，所述合成受体包含(a)抗原结合结构域；跨膜结构域；以及包含衍生自杀伤细胞免疫球蛋白样受体2dl4(kir2dl4)的10-29个氨基酸的序列的细胞内信号传导结构域；其中所述方法包括使抗原与抗原结合结构域结合，从而激活重组免疫细胞。

2、在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含seq?id?no:8或9的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含seq?id?no:8的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含seq?id?no:9的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自seq?id?no:12-16中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含seq?id?no:12的氨基酸。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含seq?id?no:13的氨基酸。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含seq?id?no:14的氨基酸。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含seq?id?no:15的氨基酸。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含seq?id?no:16的氨基酸。

3、在一些实施方案中，跨膜结构域包含seq?id?no:1、2或3的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含seq?id?no:1的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含seq?id?no:2的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含seq?id?no:3的氨基酸序列或由其组成。

4、在一些实施方案中，合成受体还包含插置在抗原结合结构域与跨膜结构域之间的铰链区。在一些实施方案中，铰链区包含seq?id?no:4或5的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链区包含seq?id?no:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链区包含seq?id?no:5的氨基酸序列。

5、在一些实施方案中，合成受体包含与选自seq?id?no:17-34中的任一个的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?idno:17的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:19的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:20的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:22的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:23的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:24的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?idno:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:29的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:30的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:32的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:33的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

6、在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或其功能片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含最小活性抗体片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单结构域抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单个轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单个重链可变结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含纳米抗体。

7、在一些实施方案中，重组免疫细胞是t细胞、自然杀伤(nk)细胞或自然杀伤型t(nk-t)细胞。在一些实施方案中，重组免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，重组免疫细胞是nk细胞。在一些实施方案中，重组免疫细胞是nk-t细胞。

8、在一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，抗原是选自由cd19、间皮素、cd123、bcma、gd2、cd30、gpc3、cd22、her2、cd20、egfr、flt3、cd33、muc-16、cs1和肿瘤新抗原组成的列表的完整蛋白或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd19或其片段。在一些实施方案中，抗原是间皮素或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd123或其片段。在一些实施方案中，抗原是bcma或其片段。在一些实施方案中，抗原是gd2或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd30或其片段。在一些实施方案中，抗原是gpc3或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd22或其片段。在一些实施方案中，抗原是her2或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd20或其片段。在一些实施方案中，抗原是egfr或其片段。在一些实施方案中，抗原是flt3或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd33或其片段。在一些实施方案中，抗原是muc-16或其片段。在一些实施方案中，抗原是cs1或其片段。在一些实施方案中，抗原是肿瘤新抗原。在一些实施方案中，抗原衍生自感染原。在一些实施方案中，感染原是细菌、病毒、真菌或寄生虫。

9、在各种实施方案中，本文还公开了一种重组免疫细胞，其包含：表达的合成受体，所述受体包含：(a)抗原结合结构域；跨膜结构域；以及包含衍生自杀伤细胞免疫球蛋白样受体2dl4(kir2dl4)的10-29个氨基酸的序列或由其组成的细胞内信号传导结构域；其中重组免疫细胞通过同源抗原与抗原结合结构域的结合被激活。

10、在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含seq?id?no:8或9的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含seq?id?no:8的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含seq?id?no:9的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自seq?id?no:12-16中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含seq?id?no:12的氨基酸。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含seq?id?no:13的氨基酸。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含seq?id?no:14的氨基酸。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含seq?id?no:15的氨基酸。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含seq?id?no:16的氨基酸。

11、在一些实施方案中，跨膜结构域包含seq?id?no:1、2或3的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含seq?id?no:1的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含seq?id?no:2的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含seq?id?no:3的氨基酸序列或由其组成。

12、在一些实施方案中，合成受体还包含插置在抗原结合结构域与跨膜结构域之间的铰链区。在一些实施方案中，铰链区包含seq?id?no:4或5的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链区包含seq?id?no:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链区包含seq?id?no:5的氨基酸序列。

13、在一些实施方案中，合成受体包含与选自seq?id?no:17-34中的任一个的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?idno:17的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:19的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:20的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:22的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:23的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:24的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?idno:28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:29的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:30的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:32的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:33的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成受体包含与seq?id?no:34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或其功能片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单链可变片段(scfv)。

14、在一些实施方案中，抗原结合结构域包含最小活性抗体片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单结构域抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单个轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单个重链可变结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含纳米抗体。

15、在一些实施方案中，重组免疫细胞是t细胞、nk细胞或nk-t细胞。在一些实施方案中，重组免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，重组免疫细胞是nk细胞。在一些实施方案中，重组免疫细胞是nk-t细胞。

16、在各种实施方案中，本文还公开了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用本文公开的重组免疫细胞。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，重组细胞对于受试者是自体的。在一些实施方案中，重组细胞对于受试者是同种异体的。

17、在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是造血系统恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤。在一些实施方案中，抗原是选自由cd19、间皮素、cd123、bcma、gd2、cd30、gpc3、cd22、her2、cd20、egfr、flt3、cd33、muc-16、cs1和肿瘤新抗原组成的列表的完整蛋白或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd19或其片段。在一些实施方案中，抗原是间皮素或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd123或其片段。在一些实施方案中，抗原是bcma或其片段。在一些实施方案中，抗原是gd2或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd30或其片段。在一些实施方案中，抗原是gpc3或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd22或其片段。在一些实施方案中，抗原是her2或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd20或其片段。在一些实施方案中，抗原是egfr或其片段。在一些实施方案中，抗原是flt3或其片段。在一些实施方案中，抗原是cd33或其片段。在一些实施方案中，抗原是muc-16或其片段。在一些实施方案中，抗原是cs1或其片段。在一些实施方案中，抗原是肿瘤新抗原。

18、在一些实施方案中，疾病是由感染原引起的感染性疾病。在一些实施方案中，感染原是细菌、病毒、真菌或寄生虫。

19、在各种实施方案中，本文还提供了一种激活表达合成受体的重组免疫细胞的方法，所述合成受体包含：(a)用于结合感兴趣的抗原的构件；(b)跨膜结构域；以及(c)包含衍生自杀伤细胞免疫球蛋白样受体2dl4(kir2dl4)的10-29个氨基酸的序列的细胞内信号传导结构域；其中所述方法包括结合感兴趣的抗原，从而激活重组免疫细胞。

20、在各种实施方案中，本文还提供了一种重组免疫细胞，其包含：表达的合成受体，所述受体包含：(a)用于结合感兴趣的抗原的构件；(b)跨膜结构域；以及(c)包含衍生自杀伤细胞免疫球蛋白样受体2dl4(kir2dl4)的10-29个氨基酸的序列或由其组成的细胞内信号传导结构域；其中重组免疫细胞通过同源抗原与抗原结合结构域的结合被激活。