犊牛腹泻主要病原三重荧光定量PCR检测方法及其应用

本发明属于分子生物学检测，涉及一种牛轮状病毒、牛冠状病毒和大肠杆菌k99三重荧光pcr检测方法及其应用。

背景技术：

1、牛轮状病毒、冠状病毒和大肠杆菌是引起牛腹泻疾病的重要病原。随着我国奶牛养殖业规?；?，集约化高度发展，牛腹泻，尤其是新生犊牛腹泻成为困扰奶牛养殖业的重要疾病之一，严重危害牛群健康并阻碍奶牛及肉牛养殖业的发展。引起犊牛腹泻的因素错综复杂，其中传染性病原引起的腹泻最为严重，且多呈混合性感染，牛轮状病毒、牛冠状病毒和大肠杆菌k99是引起牛腹泻的重要病原，三种病原引起的腹泻临床症状相似、发病急、易混合感染；因为没有鉴别诊断方法或或诊断不及时等因素，对犊牛腹泻不能采取对症治疗，致使犊牛腹泻发病率达70％，死亡率高达50％-90%，给奶牛及肉牛养殖业造成巨大的经济损失。

2、牛轮状病毒感染是由轮状病毒（bovine?rotavirus，brv）引起的多种犊牛急性胃肠道传染病，且brv能在感染牛中持续存在，表现出高感染率；?brv感染可引起犊牛精神沉郁、厌食、呕吐、腹泻、脱水等临床症状。brv对外界因素的抵抗力较强，在粪便和不含抗体的乳汁中，经半年仍有感染性?；颊呒耙愿腥菊叩姆啾隳诤写罅康穆肿床《?，并可经消化道传染给易感人畜。本病主要发生在犊牛，发病日龄主要为1～10天。春、秋两季发病较多。在发生腹泻的犊牛中，常观察到多种病原的合并感染，其中，牛轮状病毒占27～36％，是引起犊牛腹泻的主要原因，经常伴有牛冠状病毒及大肠杆菌混感而导致死亡。

3、牛冠状病毒（bovine?coronavirus，bcov）是引起成年牛冬痢和新生犊牛腹泻（腹泻粪便中常带有血液和粘液）的最主要的病原之一，bcov的感染在全世界各国广泛分布。bcov属于套式病毒目、冠状病毒科、β冠状病毒属。bcov能引起的疾病包括犊牛腹泻（calfdiarrhea，cd）和成年牛冬?。╳inter?dysentery?of?adult?cattle，wd）以及呼吸道疾病。犊牛冠状病毒病多见于1～90日龄，而腹泻常发生于1～2周龄，与轮状病毒感染很相似，而且二者容易混合发生。bcov在已有多次暴发，对新生犊牛造成较高的死亡率。肠毒素型大肠杆菌（etec）是幼龄动物腹泻常见且重要的致病菌之一，此类大肠杆菌能借助于产生的菌毛抗原粘附于动物的小肠粘膜上，定居并产生肠毒素，从而呈现出致病作用。目前在各种动物中已发现并展开研究的大肠杆菌菌毛抗原主要有k99、k88、f41等，其中k99是主要的致病抗原。

4、目前brv、bcov和的etec?k99诊断方法主要包括病原分离、常规rt-pcr、多重pcr、elisa、环介导等温扩增等方法，但上述检测方法都具有明显的局限性。为了克服常规pcr在灵敏度、效率和病原含量测定等方面存在的不足，亟需建立一种可以同时检测以上三种病原的方法，为犊牛腹泻疾病的防控提供技术支持，为养牛业健康发展保驾护航。

技术实现思路

1、本发明提供了一种犊牛腹泻主要病原三重荧光定量?pcr检测方法及其应用，解决了常规pcr在灵敏度、效率和病原含量测定等方面存在不足的问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、犊牛腹泻主要病原三重荧光定量pcr检测方法，所述方法以待检测样品的rna或dna为模板，选择bcov的n基因、brv的nsp5基因、大肠杆菌k99基因为检测靶基因，通过比对靶基因序列，筛选确定拟扩增的基因序列候选区域，然后根据确定的基因序列设计定量pcr扩增引物，并于所设计的扩增引物中间设计探针，进行荧光定量pcr检测，最后对荧光定量pcr扩增曲线及ct值进行分析，获得检测结果；

4、所述犊牛腹泻主要病原为牛轮状病毒、牛冠状病毒和大肠杆菌k99；

5、所述荧光定量pcr的扩增引物包括brv?pcr扩增引物对brv-nsp5-u、brv-nsp5-l2，bcov?pcr扩增引物对bcov?n476f、bcov?n570r和大肠杆菌k99扩增引物对k99-u1、k99-l2；所述brv-nsp5-u如seq?id?no.1所示，所述brv-nsp5-l2如seq?id?no.2所示，所述bcovn476f如seq?id?no.4所示，所述bcov?n570r如seq?id?no.5所示，所述k99-u1如seq?idno.7所示，所述k99-l2如seq?id?no.8所示。

6、进一步的，所述探针包括brv?pcr扩增引物对所对应的探针brv-nsp5-p2、bcovpcr扩增引物对所对应的探针bcov?n502p和大肠杆菌k99扩增引物对所对应的探针k99-p2；所述brv-nsp5-p2如seq?id?no.3所示，所述bcov?n502p如seq?id?no.6所示，所述k99-p2如seq?id?no.9所示。

7、进一步的，所述检测方法采用的荧光定量pcr体系为20μl，其中包括水5.4?μl，2×one?stepu?mix?10?μl，one?stepu?enzyme?mix?1?μl，brv-nsp5-u、brv-nsp5-l2各0.1μl，brv-nsp5-p2?0.1?μl，bcov?n476f、bcov?n570r各0.1?μl，bcov?n502p?0.1?μl，k99-u1、k99-l2各0.2?μl，k99?p2?0.2?μl，rox?ii参比染料0.4?μl，模板2?μl。

8、进一步的，所述检测方法采用的荧光定量pcr扩增条件为50℃?15min；95℃?30s，95℃?10s，55℃?50s，45个循环。

9、一种试剂盒，所述试剂盒中的引物为brv?pcr扩增引物对brv-nsp5-u、brv-nsp5-l2，bcov?pcr扩增引物对bcov?n476f、bcov?n570r和大肠杆菌k99扩增引物对k99-u1、k99-l2；所述brv-nsp5-u如seq?id?no.1所示，所述brv-nsp5-l2如seq?id?no.2所示，所述bcovn476f如seq?id?no.4所示，所述bcov?n570r如seq?id?no.5所示，所述k99-u1如seq?idno.7所示，所述k99-l2如seq?id?no.8所示；所述试剂盒中的探针为brv?pcr扩增引物对所对应的探针brv-nsp5-p2、bcov?pcr扩增引物对所对应的探针bcov?n502p和大肠杆菌k99扩增引物对所对应的探针k99-p2；所述brv-nsp5-p2如seq?id?no.3所示，所述bcov?n502p如seq?id?no.6所示，所述k99-p2如seq?id?no.9所示。

10、所述试剂盒在检测牛轮状病毒、牛冠状病毒和大肠杆菌k99中的其中一种或同时检测其中任意两种或同时检测三种病原中的应用。

11、本发明的有益效果如下：

12、（1）本发明检测方法为一步法荧光定量pcr方法，操作简单，节省检测时间。

13、（2）本发明可以在一个反应体系内同时检测出brv、bcov和大肠杆菌k99三种病原，显著缩短了检测时间，在提高检测效率的同时节约了成本，具有良好的应用前景。

14、（3）本发明的检测引物组是针对brv、bcov和大肠杆菌k99保守基因序列设计，利用该引物组对牛细小病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒、沙门氏菌、梭菌进行检测，均未扩增出条带，表明引物组的特异性强。

15、（4）本发明对brv、bcov和大肠杆菌k99的检测灵敏度高，可达到10?copies/μl。

16、（5）本发明的检测方法明显优于常规的rt-pcr方法，提高了检测的敏感性。

17、（6）本发明的检测方法批间重复和批内重复都很稳定，适用于临床大规模检测。