制备2-表-5-表有效醇酮的方法
【专利摘要】一种制备2?表?5?表有效醇酮的方法，设计并实现了一种新的2?表?5?表有效醇酮合成途径、即在体外利用重组表达纯化得到的转醛酶、转酮酶、5?磷酸核酮糖?3?差向异构酶、5?磷酸核糖异构酶及2?表?5?表有效醇酮合成酶，将底物6?磷酸果糖与β?羟基丙酮酸催化合成2?表?5?表有效醇酮。本发明为构建以生物质为原料的体外合成途径产氨基环醇类物质的前体提供了新的思路。
【专利说明】
制备2-表-5-表有效酵酮的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及的是一种工业酶生产领域的技术，具体涉及一种2-表-5-表有效醇酮 (2-epi-5-epi-valiolone,(2S,3S,4S,5R)-2,3,4,5-tetrahydroxy-5-(hydroxymethyl) eyelohexan-1-one)合成途径，即在体外利用转醛酶、转酮酶、5-磷酸核酮糖-3-差向异构 酶、5-磷酸核糖异构酶及2-表-5-表有效醇酮合成酶，将底物6-磷酸果糖与β-羟基丙酮酸催 化合成2-表-5-表有效醇酮、编码上述五种酶的基因的克隆表达纯化，以及在体外组装并完 成利用这些酶的催化功能合成2-表-5-表有效醇酮的应用。
【背景技术】
[0002] 生物质是地球上最丰富的可再生资源，其主要成分包括纤维素，半纤维素和木质 素等。利用化学或生物技术可将生物质原料分解成单糖组分，这种基于糖平台的生物转化 技术由于具有环境友好，条件温和等优点在燃油，化学品和其它材料的开发中备受关注并 具有良好应用前景(赵月等，新能源进展，2015,3(2):99-104)。目前生物质的化学和酶法处 理可以将半纤维素水解成戊糖，纤维素酶解成己糖，戊糖和己糖可用于化学或生物途径制 备目标产品。利用体外合成生物学技术，可将上述从生物质原料中获得的糖用于生物制氢 (You C等，Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110(18):7182- 7187.)及制备淀粉（Rollin J A等，Proceedings of the National Academy of Sciences,2015,112(16):4964-4969.)〇
[0003] 2-表-5-表有效醇酮(2-epi-5-epi-valiolone，EEV)是7-磷酸景天庚酮糖(S7P)的 环化产物，是糖尿病药物阿卡波糖、抗水稻纹枯病活性物质井闪霉素及抗生素 pyralomycin 等7碳氨基环醇类物质的前体(Mahmud T，Current Opinion in Chemical Biology，2009， 13(2) :161-170. )。2_表-5-表有效醇酮的化学合成方法是以2,3,4,6-tetra-0-benzyl-D- mannopyranose为起始，经过7步反应完成，其中的反应在-78°C的低温和室温下交替进行 (Mahmud T等，Journal of the American Chemical Society，1999,121(30):6973- 6983.)，因而开发温和的生物合成方法具有重要的意义。
[0004] 2008年，Franck等报道了 7-磷酸景天庚酮糖的酶法制备方法，该合成途径以5-磷 酸核糖和羟基丙酮酸为底物，通过转酮酶的催化生成7-磷酸景天庚酮糖和C02(Charmantray F等.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic.2009,57(1):6-9.)〇 早在2002年Zhang等报道的2-表-5-表有效醇酮的酶法合成方法也正是基于上述的途径生 成7-磷酸景天庚酮糖，同时加入了 2-epi-5-epi-valiolone合成酶催化7-磷酸景天庚酮糖 的环化反应（Zhang等，Journal of Biological Chemistry.2002,277(25):22853_ 22862.)。其反应路线见图1A。另外，在上世纪60年代Pontremoli等报道了6-磷酸果糖可在 转醛酶和转酮酶的共同催化下生成7-磷酸景天庚酮糖和5-磷酸木酮糖(Bon signore等， Journal of Biological Chemistry，1960，235(7) :1881-1887·)，该反应中的7-磷酸景天 庚酮糖可通过加入2-表-5-表有效醇酮合成酶环化为2-表-5-表有效醇酮，然而5-磷酸木酮 糖就作为了副产物(见图1B)。
【发明内容】
[0005] 本发明在调研前人工作的基础上，形成了一种创造性的构思，提出了一种制备2- 表-5-表有效醇酮的方法，通过体外组装转醛酶、转酮酶、5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶、5- 磷酸核糖异构酶及2-表-5-表有效醇酮合成酶，可以实现从6-磷酸果糖和β-羟基丙酮酸到 2-表-5-表有效醇酮的转化(见图1C)。其中转醛酶、转酮酶可催化6-磷酸果糖生成7-磷酸景 天庚酮糖和5-磷酸木酮糖，副产物5-磷酸木酮糖可在5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶、5-磷酸 核糖异构酶催化下生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖可与另一个底物β-羟基丙酮酸进一步生成 7_磷酸景天庚酮糖，最后在2-表-5-表有效醇酮合成酶作用下7-磷酸景天庚酮糖被环化为 目标产物2-表-5-表有效醇酮。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明通过体外组装转醛酶、转酮酶、5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶、5-磷酸核糖 异构酶及2-表-5-表有效醇酮合成酶，所得转醛酶、转酮酶可催化6-磷酸果糖生成7-磷酸景 天庚酮糖和5-磷酸木酮糖，副产物5-磷酸木酮糖可在5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶、5-磷酸 核糖异构酶催化下生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖与β-羟基丙酮酸进一步生成7-磷酸景天庚 酮糖，最后在2-表-5-表有效醇酮合成酶作用下7-磷酸景天庚酮糖被环化为目标产物2-表- 5-表有效醇酮。
[0008] 所述的体外组装是指:将编码转醛酶(tal)、编码转酮酶(tk)、编码5-磷酸核酮糖- 3_差向异构酶(r5p3e)、编码5-磷酸核糖异构酶（ri)或编码2-表-5-表有效醇酮合成酶 (vala)从对应的菌株全基因组DNA进行克隆并在重组大肠杆菌中进行表达和纯化，然后将 纯化后的酶与底物、辅因子在体外缓冲液中进行反应以实现组装。
[0009] 所述的菌株，具体是指：
[0010] 对应转醛酶的tal、转酮酶的tk、5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶的r5p3e、5-磷酸核 糖异构酶的ri克隆自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)基因组DNA。该菌株通过公开渠道 购自美国菌种保藏中心:http: //www · atcc · org/(保藏编号为ATCC number 43589D-2)。
[0011] 对应2-表-5-表有效醇酮合成酶的vala克隆自吸水链霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)基因组DNA。该吸水链霉菌5008通过公开渠道购自中国普通微生物菌 种保藏管理中心:http: //www· cgmcc · net/(保藏编号为CGMCC 4 · 1026)。
[0012] 所述的表达，具体是指：将编码转醛酶的tal、编码转酮酶的tk、编码5-磷酸核酮 糖-3-差向异构酶的r5p3e、编码5-磷酸核糖异构酶的ri或编码2-表-5-表有效醇酮合成酶 的vala采用基于表达质粒的异源表达方式引入微生物宿主内实现自我复制，即设计引物序 列，以相应菌株全基因组DNA为模板进行扩增，用内切酶酶切并连接到经同样内切酶酶切的 表达质粒载体上。
[0013] 所述的微生物宿主包括作为表达宿主的大肠杆菌E.coli BL21和作为克隆宿主的 大肠杆菌E.coli DH5a。
[0014] 所述的底物为6-磷酸果糖(F6P)或6-磷酸果糖与β-羟基丙酮酸(ΗΡΑ)。
[0015]所述的辅因子包括:MgCl2、硫胺素焦磷酸0??)、0)(：12、1%(：1 2、烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸(NAD+)、NaF中的任意一种或其组合。 技术效果
[0016] 与现有技术相比，本发明通过在体外将5种酶与底物，辅因子等组装完成了以6-磷 酸果糖为起始底物的2-表-5-表有效醇酮的合成，其中β-羟基丙酮酸，5-磷酸核酮糖-3-差 向异构酶和5-磷酸核糖异构酶的加入可使该途径的理论得率提高一倍；另外，最后一步2- 表-5-表有效醇酮合成酶的反应为自发反应，可使7-磷酸景天庚酮糖尽量环化为目标产物。 该途径的设计与实施有望用于以生物质为原料产2-表-5-表有效醇酮或其它氨基环醇类物 质。
【附图说明】
[0017] 图1为化学反应示意图；
[0018] 图中：Α为合成酶催化7-磷酸景天庚酮糖的环化反应、Β为7-磷酸景天庚酮糖和5- 磷酸木酮糖环化反应、C为2-表-5-表有效醇酮合成反应；
[0019] 图2为两种反应条件下2-表-5-表有效醇酮的前体一7-磷酸景天庚酮糖(S7P)的产 量示意图；
[0020] 图3为三种不同反应条件下2-表-5-表有效醇酮的产量示意图。
【具体实施方式】 实施例1
[0021] 本实施例中生物合成途径的构建是基于表达质粒的构建、异源表达、纯化，所采用 的菌株、质粒、酶与培养基等包括:表达质粒为pET28a;表达宿主为大肠杆菌E. col i BL21; 克隆宿主为大肠杆菌E.coli DH5a;基因操作工具包括:限制性内切酶、DNA聚合酶、T4 DNA 连接酶;LB培养基:每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，卡那霉素浓度根据需要 或优选为50mg/L，其具体步骤包括：
[0022] 1)PCR扩增及重组质粒的构建:设计引物序列，以相应菌株全基因组DNA为模板进 行扩增，用内切酶酶切并连接到经同样内切酶酶切的表达质粒载体上。
[0023]所述的引物序列包括：
[0024]七&1-上游引物，如369 10如.6所示，具体为： 5 '-GGAATTCCATATGATGAAGATCTTTCTGGAC-3，
[0025] t a 1 -下游引物，如S e q ID Ν ο · 7所示，具体为：5 ' - ACGCGTCGACTTATTTCTTCAGGTTCTC-3'
[0026] tk-上游引物，如Seq ID No.8所示，具体为： 5 '-GGAATTCCATATGATGGAAAGGTTTCCCTAT-3，
[0027] tk-下游引物，如Seq ID No.9所示，具体为： 5 '-ACGCGTCGACTTAGAGCATCTCTCTGAG-3，
[0028] r5p3e_上游引物，如Seq ID No. 10所示，具体为： 5 '-GGAATTCCATATGATGGTGAAAATAGCAGCTTC-3，
[0029] r5p3e_下游引物，如Seq ID No. 11所示，具体为： 5，-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTCAGCAAATTCC-3，
[0030] ri-上游引物，如Seq ID No. 12所示，具体为： 5 '-GGAATTCCATATGGTGAAGATCGCTATTGC-3，
[0031] ri下游引物，如Seq ID No· 13所示，具体为:5'-ACGCGTCGACTTAAACCTCATCGATC-3'
[0032] vala-上游引物，如Seq ID No. 14所示，具体为： 5 '-GGAATTCCATATGATGACCATGACCAAGCAGAG-3，
[0033] vala-下游引物，如Seq ID No. 15所示，具体为： 5 '-ACGCGTCGACTCACACCCCCATGTCCACGGCACCG-3'
[0034] 其中划线部分是相应的酶切位点。
[0035]质粒pET28a带有T7启动子，可通过加入IPTG诱导启动转录表达。
[0036] 2)将表达质粒载体转入大肠杆菌E.coli DH5a，筛选重组质粒，并进行测序验证， 其中4&141^5。36，1'；[分别是来源于1'1161'1]1〇1:〇83 1]^1'；[1:;[1]^的转醛酶，转酮酶，5-磷酸核酮 糖-3-差向异构酶，5-磷酸核糖异构酶的编码基因，vala是来源于Streptomyces hygroscopicus 5008的2-表-5-表有效醇酮合成酶编码基因，其氨基酸序列依次如Seq ID No. 1~5所示。
[0037] 3)将上述构建的质粒 pETSSa-taUpETSSa-tl^pETSSa-rSpSejETSSa-rlpETSSa- vala 分别转化至 E.coli BL21 感受态细胞，经过筛选和活化得到用于可诱导表达蛋白的菌 株，并保存于_80°C冰箱。
[0038] 4)从-80°C冰箱中取出构建成功的重组酶的表达菌株，接种到10mL含有卡那霉素 (50yg/mL)的LB液体培养基中，37°C，220rpm过夜培养约12-16h。于次日将菌液按照1:100 (体积比）的比例接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，220rpm培养至OD600为0.5- 0.8时，加入IPTG至终浓度为0.4mM，在相应条件下诱导表达一定时间后取出并收集菌体。菌 体收集后，加入50mM的磷酸盐缓冲液(原菌液与缓冲液体积比为10:1)并混合均匀。
[0039] 所述相应条件为质粒 pET28a-tal、pET28a-tk、pET28a-r5p3e、pET28a-ri 的诱导表 达在37°C，220rpm培养3h;pET28a-vala的诱导表达在 16°C，220rpm培养20h。
[0040] 5)将上述处理好的菌液取出放置于合适的烧杯中，并在冰浴条件下进行超声破 碎，破碎后的细胞在4°C离心收集上清，过0.45μπι滤膜后放置在冰上待用。
[0041 ] 蛋白纯化选用GE公司的HisTrap FF镍柱，具体操作为，先用约10倍柱体积（10mL， 本实施例中选用的是lmL的镍柱）的ddH20清洗镍柱，再用约5mL的磷酸盐缓冲液平衡镍柱后 上样，上样结束后用磷酸盐缓冲液继续过柱以去除未结合的蛋白，同时测定流出液的〇D280值，当其接近〇时换成洗脱液进行洗脱，并用干净的EP管进行收集，洗脱液为加入了 200mM咪 唑的磷酸盐缓冲液。收集的蛋白样品，进行〇D28Q的测定，并记录。当0D28Q值接近于洗脱液的 0D28q值时则认为蛋白已基本洗脱完成。将洗脱的蛋白样品收集，如不立即使用需加入终浓 度为10%的甘油并在_20°C保存。 实施例2
[0042] 在体外将酶，底物，辅因子等组装完成2-表-5-表有效醇酮的前体一7-磷酸景天庚 酮糖的合成。
[0043] 如图2所示，为考察了两个反应条件下2-表-5-表有效醇酮的合成情况。
[0044]图中的反应条件F指以F6P为底物，加入的tk，tal为lU/mL;反应条件冊以F6P和ΗΡΑ 为底物，加入的tk，tal，r5p3e，ri为lU/mL。
[0045] 基本反应条件中底物F6P的用量(终浓度)为0.5mM，HPA的用量为ImM(根据需要）， 辅因子MgCl2、TPP的用量分别为2mM、0.1 mM。所用缓冲液为pH 7.0的50mM Tris-HCl缓冲液。 反应温度为80°C，反应时间为0-2h。
[0046]反应样品的处理及定量测定：
[0047] 样品反应到相应时间0-2h时取出置于冰上终止反应，定量测定采用半胱氨酸-硫 酸显色法（Dische Z，Journal of Biological Chemistry. 1953,204(2) :983-998. )〇
[0048] 通过定量分析后发现，两个反应条件下都有目标物质7-磷酸景天庚酮糖的生成。
[0049] 如图2可见，ΗΡΑ支路的途径生成的7-磷酸景天庚酮糖的产量约为无 ΗΡΑ支路途径 的1.92倍，7-磷酸景天庚酮糖的得率约为理论值的62.8%。 实施例3
[0050]在体外将酶，底物，辅因子等组装完成2-表-5-表有效醇酮的合成。
[0051]如图3所示，为考察了三个反应条件下2-表-5-表有效醇酮的合成情况。
[0052]图中的反应条件Α指以F6P为底物，所用酶与比例为tal :tk:vala=l: 1:1;反应条 件B指以F6P和ΗΡΑ为底物，所用酶与比例为tal: tk:r5p3e:ri : vala = l: 1:1:1:1;反应条件C 指以F6P和ΗΡΑ为底物，所用酶与比例为tal: tk:r5p3e :ri : vala = 1:1:1:1: 5。其中比例1时 的酶活为〇.4U/mL。
[0053]基本反应条件中底物F6P的用量(终浓度)为5mM，HPA的用量为10mM(根据需要），辅 因子(：〇(：12、]\%(：12、了?？、嫩0+、似？的用量分别为0.05111]\1、2111]\1、0.1111]\1、1111]\1、21111。所用缓冲液为 pH 7.0的50mM Tris-HCl缓冲液。反应温度为40°C，反应时间为0_24h。
[0054]反应样品的处理及定量测定：
[0055] 样品反应到相应时间0_24h时取出置于冰上并立即使用冻干机冻干，冻干后的样 品使用甲醇提取三次(每次500yL甲醇，超声15min)后用氮气吹干。
[0056] 2-表-5-表有效醇酮的定量采用氢谱核磁定量法，所用仪器为Bruker Avance III 600MHz核磁共振波谱仪，内标物质为吡嗪，溶剂为氘代甲醇。
[0057]氢谱核磁定量法是将样品与内标物各指定基团上质子产生的共振峰积分值进行 比较，具体为= 其中:Ws和Wr分别为样品和内标物的绝对重量，AdPAs为内 标物和样品选定信号峰的积分值，EqR和Eqs为内标物和样品的质子当量，即Eq=M(分子量)/η (被积信号包含的质子数）。
[0058] 本实施例以内标物质吡嗪8.65ppm处的特征峰与2-表-5-表有效醇酮在2.35ppm处 的特征峰(dd双头峰)进行定量分析。
[0059]通过氢谱核磁定量后分析，三个不同反应条件下均成功合成目标物质2-表-5-表 有效醇酮。
[0060]以tal为例，通过增加了ΗΡΑ支路途径的2-表-5-表有效醇酮产量明显高于无 ΗΡΑ途 径（即反应条件Α与Β比较），且当vala增加为其它酶的5倍时（即反应条件C)，产量更高，在8h 达理论产率的88 %。在A条件下，EEV的产量很快达到平衡，为1.6mM，为理论得率(2.5mM)的 64% 〇
[0061 ]以上结果表明ΗΡΑ支路途径的设计可以提高目标产物的得率，vala酶在整个途径 中也起到了非常重要的作用。
[0062]上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同 的方式对其进行局部调整，本发明的?；し段б匀ɡ笫槲记也挥缮鲜鼍咛迨凳┧?限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
【主权项】
1. 一种制备2-表-5-表有效醇酮的方法，其特征在于，通过体外组装转醛酶、转酮酶、5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶、5-磷酸核糖异构酶及2-表-5-表有效醇酮合成酶，所得转醛酶、 转酮酶可催化6-磷酸果糖生成7-磷酸景天庚酮糖和5-磷酸木酮糖，副产物5-磷酸木酮糖可 在5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶、5-磷酸核糖异构酶催化下生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖与 β-羟基丙酮酸进一步生成7-磷酸景天庚酮糖，最后在2-表-5-表有效醇酮合成酶作用下7-磷酸景天庚酮糖被环化为目标产物2-表-5-表有效醇酮。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的体外组装是指:将编码转醛酶、编码转 酮酶、编码5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶、编码5-磷酸核糖异构酶或编码2-表-5-表有效醇 酮合成酶从对应的菌株全基因组DNA进行克隆并在重组大肠杆菌中进行表达和纯化，然后 将纯化后的酶与底物、辅因子在体外缓冲液中进行反应以实现组装。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的菌株，具体是指： 对应转醛酶的t a 1、转酮酶的t k、5 -磷酸核酮糖-3 -差向异构酶的r 5 p 3 e、5 -磷酸核糖异 构酶的ri克隆自海栖热袍菌（Thermotoga maritima)基因组DNA; 对应2-表-5-表有效醇酮合成酶的va la克隆自吸水链霉菌5008 (Strep tomyces hygroscopicus5008)基因组DNA。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的表达，具体是指:将编码转醛酶的tal、 编码转酮酶的tk、编码5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶的r5p3e、编码5-磷酸核糖异构酶的ri 或编码2-表-5-表有效醇酮合成酶的vala采用基于表达质粒的异源表达方式引入微生物宿 主内实现自我复制，即设计引物序列，以相应菌株全基因组DNA为模板进行扩增，用内切酶 酶切并连接到经同样内切酶酶切的表达质粒载体上。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的纯化，采用镍柱进行蛋白纯化。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的微生物宿主包括作为表达宿主的大肠 杆菌E.coli BL21和作为克隆宿主的大肠杆菌E.coli DH5a;所述的表达质粒为pET28a。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的底物为6-磷酸果糖或6-磷酸果糖与β-羟基丙酮酸。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的辅因子包括:MgCl2、硫胺素焦磷酸、 C〇Cl2、MgCl2、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、NaF中的任意一种或其组合。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的扩增，即PCR扩增及重组质粒的构建， 具体是指:设计引物序列，以相应菌株全基因组DNA为模板进行扩增，用内切酶酶切并连接 到经同样内切酶酶切的表达质粒载体上； 所述的引物序列包括： tal-上游引物，如Seq ID No. 6所示，具体为：5 ' -GGAATTCCATATGATGAAGATCTTTCTGGAC- 3、tal-下游引物，如Seq ID No·7所示，具体为：5'-ACGCGTCGACTTATTTCTTCAGGTTCTC-3' ； tk-上游引物，如Seq ID No·8所示，具体为：5'-GGAATTCCATATGATGGAAAGGTTTCCCTAT-3'、tk-下游引物，如Seq ID No·9所示，具体为：5'-ACGCGTCGACTTAGAGCATCTCTCTGAG-3' ； r5p3e_上游引物，如Seq ID No. 10所示，具体为：5 GGAATTCCATATGATGGTGAAAATAGCAGCTTC-3'、r5p3e-下游引物，如Seq ID No. 11所示，具体 为：5 '-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTCAGCAAATTCC-3'； ri-上游引物，如Seq ID No· 12所示，具体为：5'-GGAATTCCATATGGTGAAGATCGCTATTGC- 3'、ri下游引物，如Seq ID No· 13所示，具体为:5'-ACGCGTCGACTTAAACCTCATCGATC-3' ； vala-上游引物，如Seq ID Νο·14所示，具体为：5'_ GGAATTCCATATGATGACCATGACCAAGCAGAG-3'、vala-下游引物，如Seq ID No. 15所示，具体为： 5 '-ACGCGTCGACTCACACCCCCATGTCCACGGCACCG-3'； 其中划线部分是相应的酶切位点。
【文档编号】C12N15/70GK105838744SQ201610264164
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】钟建江, 黄松燕
【申请人】上海交通大学