包含源自非洲猪瘟病毒的抗原蛋白的用于预防非洲猪瘟的疫苗的制作方法

本发明涉及包含源自非洲猪瘟病毒(african?swine?fever?virus)的抗原蛋白作为有效成分的用于预防非洲猪瘟的疫苗等。本发明要求于2021年8月27日提交且申请号为第10-2021-0114014号及于2022年8月4日提交且申请号为第10-2022-0097525号的韩国专利申请的优先权，其公开在说明书及附图中的全部内容通过引用结合在本技术中。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african?swine?fever，asf)为感染非洲猪瘟病毒科(asfarviridae)的非洲猪瘟病毒(african?swine?fever?virus，asfv)引起的猪瘟，1921年在肯尼亚首次报告后，主要在撒哈拉以南地区有报告，2007年以后，其范围开始扩大至黑海沿岸的乔治亚、亚美尼亚、阿塞拜疆等非洲以外地区。尤其，中国占全球养猪量的一半左右，2018年首次爆发的asf正式扑杀了约700万头猪，实际估计扑杀了约2亿头猪，造成了巨大的财产损失。此后一直控制asf发病，但今年年初中国北部地区又再次报告了asf病例。越南今年也再次发生asf疫情，截至今年5月，仅2021年就宰杀了约36000头猪，2019年开始宰杀了600多万头猪，但在越南全国不断报告新的病例。此外，没有发病病例的马来西亚也在今年2月末首次检测出asf病毒。

2、在韩国，2019年在坡州养猪户首次报告了asf疫情，此后京畿道及江原道一带陆续报告感染病例。以2020年9月左右为准，在野生野猪中确认非洲猪瘟的市郡在京畿道有坡州市、涟川郡、抱川市，在江原道有铁原郡、华川郡、春川市、杨口郡、麟蹄郡、高城郡等9处。其中，江原道华川市最多，达285件，其次是京畿道涟川郡282件，京畿道坡州市以98件紧随其后。因此，为防止asf扩散，设置了广域围栏，并实施了积极的野猪捕获和防疫，结果2020年10月江原道华川养猪场发生感染病例后，一段时间内没有报告asfv感染病例，但最近(2021年8月)江原道养猪场再次报告了asf发病病例。

3、猪感染非洲猪瘟时致死率高达100％，而且由于没有针对该疾病的疫苗研发，是一种发生后需要立即处理的高风险传染病，预防其仍然是一个非常重要的问题。

4、另一方面，分子生物学和基因工程技术的辉煌发展也适用于植物领域，且一直努力从植物体生产有用生理活性物质。从植物中生产有用物质可以显著降低生产成本，不仅可以从源头上排除传统方法(从动物细胞或微生物中合成蛋白质并进行分离提纯的方法)可能产生的各种污染源(病毒、癌基因、肠毒素等)，而且在商品化阶段，与动物细胞或微生物不同，可作为种子管理种苗(seed?stock)方面具有有利的优势。

5、对此，本发明人为开发用于预防非洲猪瘟的抗原而努力的结果，最终开发出了可以在植物体内高效表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的系统，且确认了上述抗原蛋白中特定蛋白质的组合比其他asfv抗原蛋白组合更能有效预防非洲猪瘟，从而完成了本发明。

技术实现思路

1、技术问题

2、非洲猪瘟病毒为在感染细胞的细胞质中复制的巨型双螺旋dna病毒。该病毒在给猪造成高致死率的出血热的同时，在没有疾病征兆的情况下，可以使起到媒介物作用的自然宿主猪、黑野猪、江野猪等持续感染软蜱科的钝缘蜱(ornithodoros)属。这种病毒会导致猪出现致命的出血热，因此在感染前的提前预防是非常重要的传染病。

3、本发明是为了解决如上所述的非洲猪瘟的预防必要性和现有技术上的问题而导出，其目的在于，提供一种重组源自非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白、包含其的疫苗组合物等，其中，不仅可实现利用植物体的有效生产，还可示出高免疫原性(immunogenicity)。

4、但是，本发明所要解决的技术问题并不局限于以上所提及的问题，普通技术人员可通过以下记载明确理解未提及的其他问题。

5、技术方案

6、本发明提供一种疫苗组合物，其为包含非洲猪瘟病毒(african?swine?fevervirus，asfv)抗原蛋白的组合作为有效成分的用于预防非洲猪瘟的疫苗组合物，上述asfv抗原蛋白的组合为选自由凝集素(lectin)、cd2v、p72、p54及p30蛋白组成的组中的一种以上的组合。

7、但在上述asfv抗原蛋白的组合包含凝集素蛋白及cd2v蛋白的情况下，上述asfv抗原蛋白的组合由三种以上的抗原蛋白组成。

8、在本发明的另一实施方式中，上述疫苗组合物可满足由下述特征组成的组中的一个以上的特征，但并不限定于此：

9、(a)上述凝集素蛋白包含seq?id?no:1的氨基酸序列；

10、(b)上述cd2v蛋白包含seq?id?no:3的氨基酸序列；

11、(c)上述p72蛋白包含seq?id?no:5的氨基酸序列；

12、(d)上述p54蛋白包含seq?id?no:7的氨基酸序列；以及

13、(e)上述p30蛋白包含seq?id?no:9的氨基酸序列。

14、在本发明的再一实施方式中，上述asfv抗原蛋白是利用重组载体生产的，上述重组载体可包含由下述多核苷酸组成的组中的一种以上的asfv蛋白-编码多核苷酸，但并不限定于此：

15、(a)包含由seq?id?no:2表示的碱基序列的凝集素-编码多核苷酸；

16、(b)包含由seq?id?no:4表示的碱基序列的cd2v-编码多核苷酸；

17、(c)包含由seq?id?no:6表示的碱基序列的p72-编码多核苷酸；

18、(d)包含由seq?id?no:8表示的碱基序列的p54-编码多核苷酸；以及

19、(e)包含由seq?id?no:10表示的碱基序列的p30-编码多核苷酸。

20、在本发明的还有一实施方式中，上述重组载体还可包含由下述多核苷酸组成的组中的一种以上，但并不限定于此：

21、(a)编码seq?id?no:19的nb或seq?id?no:21的bip的多核苷酸；

22、(b)编码seq?id?no:27的pfc2片段的多核苷酸；

23、(c)编码seq?id?no:29的hdel肽的多核苷酸；以及

24、(d)编码seq?id?no:23的m结构域或seq?id?no:25的多组氨酸标签(polyhistidine?tag)的多核苷酸。

25、在本发明的又一实施方式中，上述asfv抗原蛋白可在由上述重组载体转化的植物体中生产，但并不限定于此。

26、在本发明的又一实施方式中，上述疫苗组合物还可包含佐剂(adjuvant)，但并不限定于此。

27、在本发明的又一实施方式中，上述佐剂可以为矿物油(mineral?oil)或基于emulsigen的佐剂，但并不限定于此。

28、此外，本发明提供一种包含本发明的疫苗组合物的用于预防非洲猪瘟的疫苗试剂盒。

29、此外，本发明提供一种非洲猪瘟的预防、改善和/或治疗方法，其包括向除人以外的动物施用本发明的组合物(或者，选自由凝集素、cd2v、p72、p54及p30蛋白组成的组中的一种以上的蛋白质组合)的步骤。

30、而且，本发明提供一种上述组合物的预防、改善和/或治疗非洲猪瘟中的用途。

31、而且，本发明提供一种上述组合物的制备用于预防非洲猪瘟的疫苗中的用途。

32、此外，本发明提供一种饲料组合物，其为包含非洲猪瘟病毒(african?swinefever?virus，asfv)抗原蛋白的组合作为有效成分的用于预防非洲猪瘟的饲料组合物，上述asfv抗原蛋白的组合为选自由凝集素、cd2v、p72、p54及p30蛋白组成的组中的一种以上的组合。

33、但在上述asfv抗原蛋白的组合包含凝集素蛋白及cd2v蛋白的情况下，上述asfv抗原蛋白的组合由三种以上的抗原蛋白组成。

34、此外，本发明提供一种用于表达非洲猪瘟病毒的抗原蛋白的重组载体，其包含：编码包含seq?id?no:5的氨基酸序列的p72蛋白的多核苷酸；编码包含seq?id?no:7的氨基酸序列的p54蛋白的多核苷酸；编码包含seq?id?no:11的氨基酸序列的p15蛋白的多核苷酸；编码包含seq?id?no:13的氨基酸序列的p35蛋白的多核苷酸；编码包含seq?id?no:15的氨基酸序列的e199l蛋白的多核苷酸；或者编码包含seq?id?no:17的氨基酸序列的f317l蛋白的多核苷酸。

35、上述用于表达非洲猪瘟病毒的抗原蛋白的重组载体在植物体中表达。

36、在本发明的一实施方式中，上述重组载体可满足选自由下述特征组成的组中的一个以上的特征，但并不限定于此：

37、(a)编码上述p72蛋白的多核苷酸包含由seq?id?no:6表示的碱基序列；

38、(b)编码上述p54蛋白的多核苷酸包含由seq?id?no:8表示的碱基序列；

39、(c)编码上述p15蛋白的多核苷酸包含由seq?id?no:12表示的碱基序列；

40、(d)编码上述p35蛋白的多核苷酸包含由seq?id?no:14表示的碱基序列；

41、(e)编码上述e199l蛋白的多核苷酸包含由seq?id?no:16表示的碱基序列；以及

42、(f)编码上述f317l蛋白的多核苷酸包含由seq?id?no:18表示的碱基序列。

43、在本发明的另一实施方式中，上述重组载体还可包含编码seq?id?no:19的新型伴侣结合蛋白(new?chaperone?binding?protein，nb)的多核苷酸或编码seq?id?no:21的伴侣结合蛋白(chaperone?binding?protein，bip)的多核苷酸，但并不限定于此。

44、在本发明的再一实施方式中，编码上述nb或bip的多核苷酸可位于编码上述p72蛋白、p54蛋白、p15蛋白、p35蛋白、e199l蛋白或f317l蛋白的多核苷酸的5'末端方向上，但并不限定于此。

45、在本发明的还有一实施方式中，上述重组载体还可包含编码seq?id?no:27的pfc2(porcine?fc)片段的多核苷酸，但并不限定于此。

46、在本发明的又一实施方式中，编码上述pfc2片段的多核苷酸可位于编码上述p72蛋白、p54蛋白、p15蛋白、p35蛋白、e199l蛋白或f317l蛋白的多核苷酸的3'末端方向上，但并不限定于此。

47、在本发明的又一实施方式中，上述重组载体还可包含编码seq?id?no:29的hdel(his-asp-glu-leu)肽的多核苷酸，但并不限定于此。

48、在本发明的又一实施方式中，编码上述hdel肽的多核苷酸可位于编码上述p72蛋白、p54蛋白、p15蛋白、p35蛋白、e199l蛋白或f317l蛋白的多核苷酸的3'末端方向上，但并不限定于此。

49、在本发明的又一实施方式中，上述重组载体还可包含编码seq?id?no:19的nb或seq?id?no:21的bip的多核苷酸；编码seq?id?no:27的pfc2片段的多核苷酸；以及编码seqid?no:29的hdel肽的多核苷酸，但并不限定于此。

50、在本发明的又一实施方式中，上述重组载体中，依次连接有：编码nb或bip的多核苷酸；编码p72蛋白、p54蛋白、p15蛋白、p35蛋白、e199l蛋白或f317l蛋白的多核苷酸；编码pfc2片段的多核苷酸；以及编码hdel肽的多核苷酸，但并不限定于此。

51、此外，本发明提供一种由本发明的重组载体转化的转基因生物体。

52、在本发明的一实施方式中，上述转基因生物体可以为植物体，但并不限定于此。

53、此外，本发明提供一种重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白的制备方法，其包括如下的步骤：

54、步骤(s1)，将本发明的重组载体转化至植物体；以及

55、步骤(s2)，从上述植物体或培养液分离及纯化重组抗原蛋白。

56、在本发明的一实施方式中，上述nb-编码多核苷酸可包含由seq?id?no:20表示的碱基序列；上述bip-编码多核苷酸可包含由seq?id?no:22表示的碱基序列；上述pfc2-编码多核苷酸可包含由seq?id?no:28表示的碱基序列；hdel-编码多核苷酸可包含由seq?idno:30表示的碱基序列，但并不限定于此。

57、发明效果

58、用于预防包括非洲猪瘟的病毒性疾病的蛋白质，尤其，抗原因蛋白质的折叠(folding)、糖化过程(glycosylation)等的问题，无法利用细菌，主要利用动物细胞来生产。但是，利用动物细胞的疫苗生产方法中，用于批量生产的设备扩充需要很大的费用，因此，不易制备，且在大部分的情况下，抗原的价格都是高价。并且，利用动物细胞制备的抗原具有不易储存、被可感染动物的病毒污染的可能性高的缺点。但是，本发明利用植物来弥补了缺点。即，与动物细胞不同地，植物细胞被可感染动物的病毒污染的可能性非常低，只要确保耕种面积，就可以随时批量生产，而且，可通过植物体长期保存，因此可稳定地生产低廉的抗原。

59、本发明的重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白不仅可在植物体中有效地表达，还具有高水溶性(water?solubility)，因此容易分离及纯化，并且，在体内作为抗原发挥作用，并示出高免疫原性，从而可用作新形非洲猪瘟病毒疫苗组合物。尤其，本发明人通过攻击接种实验确认了，包含本发明的5种抗原蛋白(凝集素、cd2v、p54、p72及p30)的疫苗组合物与还包含其他抗原蛋白(p15、p35、e199l、f317l等)的疫苗组合物相比预防非洲猪瘟的效果非常显著，从而有望将本发明的重组载体及疫苗组合物广泛用于畜产行业等。