用于调节诸基因表达的组合物和方法与流程

背景技术：

1、人类许多疾病和障碍由某些蛋白质的表达水平相比于未患这类疾病或障碍的人类中这些蛋白质的表达水平更高和/或更低的组合所引起。用单个构建体选择性增加靶蛋白的表达并减少另一种不同靶蛋白的表达的rna疗法可能具有治疗效果。然而，外源rna可能引发不期望的先天免疫应答。因此，需要开发免疫原性降低的rna疗法，以避免不必要的先天免疫激活。

技术实现思路

1、本文提供了使用一种重组多核酸构建体或rna构建体同时调节两种或三种或更多种蛋白质表达的组合物和方法。例如，本文提供的组合物和方法可用于增加第一种蛋白质的表达并减少第二种蛋白质的表达。例如，本文提供的组合物和方法可用于增加第一种蛋白质的表达、减少第二种蛋白质的表达并减少第三种蛋白质的表达。

2、在一些方面，本文提供了一种包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含：(i)第一rna序列，其编码目的基因；和(ii)第二rna序列，其包含至少两个调节一个或多个靶rna表达的遗传元件；其中人细胞与重组rna构建体接触导致免疫应答低于人细胞与相应的重组rna构建体接触的免疫应答，该相应的重组rna构建体包含(i)的第一rna序列和(ii)的具有至少两个遗传元件中的至多一个的相应的第二rna序列。在一些实施方案中，重组rna构建体包含一个或多个尿苷。在一些实施方案中，重组rna构建体不包含修饰的尿苷。在一些实施方案中，核苷酸变体包含修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷包含n1-甲基假尿苷。

3、在一些方面，本文提供了一种包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含：(i)第一rna序列，其编码目的基因；和(ii)第二rna序列，其包含至少两个调节一个或多个靶rna表达的遗传元件；其中该重组rna构建体不包含核苷酸变体。

4、在一些方面，本文提供了一种包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含：(i)第一rna序列，其编码目的基因；和(ii)第二rna序列，其包含至少两个调节一个或多个靶rna表达的遗传元件；其中该重组rna构建体不包含修饰的尿苷。

5、在一些方面，本文提供了一种包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含：(i)第一rna序列，其编码目的基因；和(ii)第二rna序列，其包含至少两个调节一个或多个靶rna表达的遗传元件；其中该重组rna构建体不包含n1-甲基假尿苷。

6、在一些方面，本文提供了一种包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含：(i)第一rna序列，其编码目的基因；和(ii)第二rna序列，其包含至少两个调节一个或多个靶rna表达的遗传元件；其中该重组rna构建体仅包含未修饰的核苷酸或天然的核苷酸。

7、在一些方面，本文提供了一种包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含：(i)第一rna序列，其编码目的基因；和(ii)第二rna序列，其包含至少两个调节一个或多个靶rna表达的遗传元件；其中重组rna构建体包含尿苷，其中(a)重组rna构建体包含的所有尿苷都是未修饰的或天然的核苷酸；或(b)重组rna构建体包含的至少一个尿苷是未修饰的尿苷。

8、在一些方面，本文提供了一种用于调节细胞中两个或更多个基因表达的组合物。在一些方面，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文所述的任何一种组合物和药学上可接受的赋形剂。在一些方面，本文提供了一种载体，其包含编码本文所述的任一种组合物的重组多核酸构建体。在一些方面，本文提供了一种细胞，其包含本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种载体。

9、在一些方面，本文提供了一种在细胞中同时表达来自单个rna转录本的sirna和mrna的方法，其包含将本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种载体引入细胞。

10、在一些方面，本文提供了一种治疗疾病或病症的方法，其包含向有需要的个体施用本文所述的任何一种组合物或本文所述的任何一种药物组合物。

11、在一些方面，本文提供了一种包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含：(i)编码胰岛素样生长因子1(igf-1)的信使rna(mrna)；和(ii)至少两个能够结合白细胞介素-8(il-8)mrna的小干扰rna(sirna)；其中人细胞与重组rna构建体接触导致的免疫应答低于人细胞与相应的重组rna构建体接触的免疫应答，该相应的重组rna构建体包含(i)的编码igf-1的mrna以及(ii)的至少两个能够结合il-8mrna的sirna中的至多一个。

12、在一些方面，本文提供了一种包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含：(i)编码胰岛素样生长因子1(igf-1)的信使rna(mrna)；和(ii)至少两个能够结合白细胞介素-1β(il-1β)mrna的小干扰rna(sirna)；其中人细胞与重组rna构建体接触导致的免疫应答低于人细胞与相应的重组rna构建体接触的免疫应答，该相应的重组rna构建体包含(i)的编码igf-1的mrna以及(ii)的至少两个能够结合il-1βmrna的sirna中的至多一个。

13、在一些方面，本文提供了一种包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含：(i)编码白细胞介素-4(il-4)的信使rna(mrna)；和(ii)至少两个能够结合肿瘤坏死因子α(tnf-α)mrna的小干扰rna(sirna)；其中人细胞与重组rna构建体接触导致的免疫应答低于人细胞与相应的重组rna构建体接触的免疫应答，该相应的重组rna构建体包含(i)的编码il-4的mrna以及(ii)的至少两个能够结合tnf-αmrna的sirna中的至多一个。

14、在一些方面，本文提供了一种包含重组rna构建体的组合物，该重组rna构建体包含：(i)编码白细胞介素-4(il-4)的信使rna(mrna)；和(ii)至少两个能够结合肿瘤坏死因子α(tnf-α)mrna和白细胞介素17(il-17)的小干扰rna(sirna)；其中人细胞与重组rna构建体接触导致的免疫应答低于人细胞与相应的重组rna构建体接触的免疫应答，该相应的重组rna构建体包含(i)的编码il-4的mrna以及(ii)的至少两个能够结合tnf-αmrna和il-17mrna的sirna中的至多一个。

15、在一些方面，本文提供了一种包含重组多核酸构建体的组合物，该重组多核酸构建体包含选自seq?id?no：1-24、42、125、97-108、121-122和127-128的核酸序列。

16、通过引用并入

17、本说明书提到的全部出版物、专利和专利申请均通过引用方式并入本文至如下程度，即如同专门且独立地指出通过引用方式并入每份单独出版物、专利和专利申请。

技术特征：

1.包含重组rna构建体的组合物，所述重组rna构建体包含：

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述重组rna构建体包含一个或多个尿苷。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述重组rna构建体不包含修饰的尿苷。

4.包含重组rna构建体的组合物，其包含：

5.包含重组rna构建体的组合物，所述重组rna构建体包含：

6.包含重组rna构建体的组合物，所述重组rna构建体包含：

7.包含重组rna构建体的组合物，所述重组rna构建体包含：

8.包含重组rna构建体的组合物，所述重组rna构建体包含：

9.根据权利要求4所述的组合物，其中所述核苷酸变体包含修饰的尿苷。

10.根据权利要求3、5和9中任一项所述的组合物，其中所述修饰的尿苷包含n1-甲基假尿苷。

11.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述相应的重组rna构建体不包含调节一个或多个靶rna表达的任何遗传元件。

12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列包含至少三个调节一个或多个靶rna表达的遗传元件。

13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列包含至少六个调节一个或多个靶rna表达的遗传元件。

14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一rna序列是信使rna(mrna)序列。

15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列的至少两个遗传元件中的每一个都包含二级结构。

16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列的至少两个遗传元件中的每一个都包含发夹结构或环结构。

17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列的至少两个遗传元件中的每一个都为短或小发夹rna(shrna)。

18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列的至少两个遗传元件中的每一个都被胞内蛋白质加工或切割。

19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列的至少两个遗传元件中的每一个都被细胞的内源性蛋白质加工或切割。

20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列的至少两个遗传元件中的每一个都被内源性dicer加工或切割。

21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列的至少两个遗传元件中的每一个都包含小干扰rna(sirna)。

22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列的至少两个遗传元件中的每一个都能够结合所述一个或多个靶rna。

23.根据权利要求1至3或11至22中任一项所述的组合物，其中所述免疫应答为人toll样受体7(tlr7)免疫应答、干扰素α/β(ifnα/β)免疫应答、人toll样受体3(tlr3)免疫应答、人toll样受体8(tlr8)免疫应答或其任何组合。

24.根据权利要求1至3或11至23中任一项所述的组合物，其中根据人toll样受体7(tlr7)免疫原性试验，所述人细胞与所述重组rna构建体接触导致的免疫应答低于所述人细胞与所述相应的重组rna构建体接触的免疫应答。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述人tlr7免疫原性试验测量nf-κb和/或ap1的激活。

26.根据权利要求24或25所述的组合物，其中所述人tlr7免疫原性试验在hek293细胞或其衍生物中进行。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述hek293细胞经工程改造以表达htlr7和报告基因。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述报告基因是分泌型报告基因。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述分泌型报告基因是分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的组合物，其中所述报告基因受具有一个或多个nf-κb和/或ap1结合位点的启动子控制。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述启动子是ifn-β最小启动子。

32.根据权利要求24至31中任一项所述的组合物，其中与所述重组rna构建体接触的所述人细胞中的免疫应答比与所述相应的重组rna构建体接触的所述人细胞中的免疫应答低至少1.5倍或至少2倍。

33.根据权利要求1至3或11至23中任一项所述的组合物，其中根据干扰素α/β(ifnα/β)免疫原性试验，所述人细胞与所述重组rna构建体接触导致的免疫应答低于所述人细胞与所述相应的重组rna构建体接触的免疫应答。

34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述ifnα/β免疫原性试验测量jak-stat和/或isg3的激活。

35.根据权利要求33或34所述的组合物，其中所述ifnα/β免疫原性试验在hek293细胞或其衍生物中进行。

36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述hek293细胞经工程改造以表达人stat2和/或irf9基因和报告基因。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述报告基因是分泌型报告基因。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述分泌型报告基因是分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)。

39.根据权利要求36至38中任一项所述的组合物，其中所述报告基因受具有一个或多个stat2和/或irf9结合位点的启动子控制。

40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述启动子是isg54启动子。

41.根据权利要求33至40中任一项所述的组合物，其中与所述重组rna构建体接触的所述人细胞中的免疫应答比与所述相应的重组rna构建体接触的所述人细胞中的免疫应答低至少1.5倍、至少2倍或至少100倍。

42.根据权利要求1至3或11至23中任一项所述的组合物，其中根据人toll样受体3(tlr3)免疫原性试验，所述人细胞与所述重组rna构建体接触不会导致实质性免疫应答。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述人tlr3免疫原性试验测量nf-κb和/或ap1的激活。

44.根据权利要求42或43所述的组合物，其中所述人tlr3免疫原性试验在hek293细胞或其衍生物中进行。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述hek293细胞经工程改造以表达htlr3和报告基因。

46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述报告基因是分泌型报告基因。

47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述分泌型报告基因是分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)。

48.根据权利要求45至47中任一项所述的组合物，其中所述报告基因受具有一个或多个nf-κb和/或ap1结合位点的启动子控制。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述启动子是ifn-β最小启动子。

50.根据权利要求1至3或11至23中任一项所述的组合物，其中根据人toll样受体8(tlr8)免疫原性试验，所述人细胞与所述重组rna构建体接触导致的免疫应答低于所述人细胞与所述相应的重组rna构建体接触的免疫应答。

51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述人tlr8免疫原性试验测量nf-κb、ap1和/或irf的激活。

52.根据权利要求50或51所述的组合物，其中所述人tlr8免疫原性试验在hek293细胞或其衍生物中进行。

53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述hek293细胞经工程改造以表达htlr8和报告基因。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述报告基因是分泌型报告基因。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述分泌型报告基因是分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)。

56.根据权利要求53至55中任一项所述的组合物，其中所述报告基因受具有一个或多个nf-κb和/或ap1结合位点的启动子控制。

57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述启动子是ifn-β最小启动子。

58.根据权利要求1至3或11至22中任一项所述的组合物，其中所述免疫应答诱导细胞中促炎细胞因子的表达。

59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述促炎细胞因子包含白细胞介素6(il-6)。

60.根据权利要求58或59所述的组合物，其中所述细胞包含人肺上皮癌细胞(a549)或人单核细胞白血病细胞(thp-1)。

61.根据权利要求21至60中任一项所述的组合物，其中所述第二rna序列包含2、3、4、5、6个或更多个sirna，其中所述2、3、4、5、6个或更多个sirna包括能够结合以下各项的sirna：

62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述第二rna序列包含至少3种sirna。

63.根据权利要求61所述的组合物，其中所述第二rna序列包含至少6种sirna。

64.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组rna构建体还包含一个或多个接头。

65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述一个或多个接头中的每一个具有选自以下的结构：

66.根据权利要求64所述的组合物，其中所述一个或多个接头中的每一个都包含了含有acaacaa的序列。

67.根据权利要求64所述的组合物，其中所述一个或多个接头中的每一个不是：(a)tttatcttagaggcatatccctacgtaccaacaa或atagtgagtcgtattaacgtaccaacaa；或(b)根据rnafold?webserver不形成二级结构。

68.根据权利要求64至67中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个接头中的每一个位于：(a)所述第一rna序列和所述第二rna序列之间；(b)所述第二rna序列的2、3、4、5、6种或更多种sirna中的每一种之间；或(c)(a)和(b)两者。

69.根据权利要求64至68中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个接头中的每一个都包含独立地选自seq?id?no：27、28、85-95的序列。

70.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述目的基因的表达受到调节。

71.根据权利要求70所述的组合物，其中所述目的基因的表达在包含所述重组rna构建体的细胞中被上调。

72.根据权利要求70所述的组合物，其中由所述目的基因编码的蛋白质的表达在包含所述重组rna构建体的细胞中被上调。

73.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个靶rna的表达受到调节。

74.根据权利要求73所述的组合物，其中所述一个或多个靶rna的表达被所述调节一个或多个靶rna表达的遗传元件下调。

75.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述调节一个或多个靶rna的表达的遗传元件不抑制所述目的基因的表达。

76.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述目的基因选自白细胞介素4(il-4)和胰岛素样生长因子1(igf-1)。

77.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个靶rna包含非编码rna或信使rna(mrna)。

78.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个靶rna中的每一个都为非编码rna。

79.根据权利要求1至77中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个靶rna中的每一个都为mrna。

80.根据权利要求1至77中任一项所述的组合物，其中所述靶rna为mrna，其编码包含白细胞介素8(il-8)、白细胞介素1β(il-1β)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素17(il-17)或其功能变体的蛋白质。

81.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述调节一个或多个靶rna表达的遗传元件结合所述一个或多个靶rna的外显子。

82.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述调节一个或多个靶rna表达的遗传元件特异性结合一个靶rna。

83.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述调节一个或多个靶rna表达的遗传元件不由所述目的基因的内含子序列编码或不由其组成。

84.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述目的基因在没有rna剪接的情况下表达。

85.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一rna序列位于所述第二rna序列的下游或3’。

86.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一rna序列位于所述第二rna序列的上游或5’。

87.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述rna构建体包含位于所述第一rna序列的上游或5’的内部核糖体进入位点(ires)。

88.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，还包含poly(a)尾、5’帽或kozak序列。

89.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一rna序列和所述第二rna序列都是重组的。

90.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述sirna包含选自seq?id?no：57-70的有义链序列。

91.根据前述权利要求中任一项所述的组合物用于调节细胞中两个或更多个基因的表达。

92.药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至90中任一项所述的组合物和药学上可接受的赋形剂。

93.载体，其包含编码根据权利要求1至90中任一项所述的组合物的重组多核酸构建体。

94.细胞，其包含根据权利要求1至90中任一项所述的组合物或根据权利要求93所述的载体。

95.在细胞中同时表达来自单个rna转录本的sirna和mrna的方法，其包含将根据权利要求1至90中任一项所述的组合物或根据权利要求93所述的载体引入所述细胞。

96.治疗疾病或病症的方法，其包含向有需要的个体施用根据权利要求1至90中任一项所述的组合物或根据权利要求92所述的药物组合物。

97.根据权利要求96所述的方法，其中所述疾病或病症包含皮肤疾病或病症、或关节疾病或病症。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述皮肤疾病或病症包含炎性皮肤病。

99.根据权利要求98所述的方法，其中所述炎性皮肤病包含银屑病。

100.根据权利要求97所述的方法，其中所述关节疾病或病症包含关节退化。

101.根据权利要求100所述的方法，其中所述关节退化包含椎间盘疾病(ivdd)或骨关节炎(oa)。

102.根据权利要求96至101中任一项所述的方法，其中所述个体是人。

103.包含重组rna构建体的组合物，所述重组rna构建体包含：

104.包含重组rna构建体的组合物，所述重组rna构建体包含：

105.包含重组rna构建体的组合物，所述重组rna构建体包含：

106.包含重组rna构建体的组合物，所述重组rna构建体包含：

107.包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体包含选自seq?id?no：1-24、42、125、97-108、121-122和127-128的核酸序列。

技术总结
本发明涉及用于调节诸基因表达的组合物和方法，其包含重组多核酸构建体或RNA构建体，该重组多核酸构建体或RNA构建体包含：第一RNA序列，其编码目的基因；和第二RNA序列，其包含至少两个调节一个或多个靶RNA表达的遗传元件。本文所述的重组RNA构建体在人细胞中诱导的免疫应答低于由相应的重组RNA构建体诱导的免疫应答，该相应的重组RNA构建体包含：第一RNA序列，其编码目的基因；和相应的第二RNA序列，其包含至少两个遗传元件中的至多一个。本文还公开了该组合物在治疗疾病和调节两个或更多个基因表达中的用途。

技术研发人员：J·A·塞尔瓦拉吉,K·P·祖伊德维尔德,P·希尔曼-伍尔纳,F·梅茨格
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技术研发日：
技术公布日：2024/4/8