基于2-ΔΔCT方法检测SMN1基因和SMN2基因拷贝数的试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及分子生物学，特别涉及基于2-δδct方法检测smn1基因和smn2基因拷贝数的试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、脊髓性肌萎缩症的主要致病基因是5q13.3区域的两个高度同源的运动神经元存活基因smn，包括位于端粒侧的smn1和位于着丝粒侧部位的smn2。前者被认为是sma的关键致病基因。约95~98%是拷贝数变异，即smn1的7和8号外显子纯合缺失，2~5%是复合杂合变异，即smn1的7和8号外显子杂合缺失及smn1微小变异?；蛲槐涞贾聅mn1基因的表达完全或部分缺失，神经元发生病理改变从而影响其功能。

2、脊髓性肌萎缩症（spinal?muscular?atrophy,?sma）是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病,?临床特征是脊髓前角细胞变性退化、导致对称性肌无力和肌萎缩，是一种常见的运动神经元疾病，主要表现为肌肉萎缩、肌张力低、腱反射减弱、病理征阴性，目前尚无有效治疗手段，被称为“2岁以下婴幼儿头号遗传病杀手”。sma通常根据疾病严重程度与发病年龄分为5个亚型：0型患者在出生前或出生时发病，自然病程只有数月。1型患者在出生时或在6个月之前开始发病，不能独自坐或走，并且通常在两年内死于呼吸功能不全。2型患者在6个月之后发病，可以独坐但在没有任何辅助设备帮助的情况下不能走路，大部分可生存至成年。3型患者通常在1岁半后发病，可以独立地坐或走路，但在青春期或成人后一般行走能力有所退步，需要靠轮椅行动。4型患者为晚发型，一般到成人期才发病，具有跑跳等所有运动能力，寿命一般不受影响。脊髓性肌萎缩症在人群中的携带率约为1/35-1/50左右，发病率约为1/6000-1/10000左右。

3、sma诊断和检测方法有很多，但存在不够准确、操作复杂等其他缺点。例如pcr-rflp或一代测序，对目标区域进行扩增，通过限制性内切酶或一代测序的方法来区分，但存在酶切不彻底的隐患，不能区分携带者与正常人。荧光定量pcr，通过两个多重实时荧光定量pcr反应，分别对smn1基因第7和第8外显子进行拷贝数相对定量，来判断是否发生缺失或转换。优势是可以区分患者，携带者、正常人，但不能识别smn1点突变和2+0基因型。arms方法通过引入错配碱基，可以较好地区别smn1和smn2基因，但理论上一个扩增体系只能检测一个靶点的拷贝数，另一个靶点的扩增会被抑制，通量较低，更适合snp分型而不是拷贝数的检测；另外，该方法不适合gc含量过低或过高的序列检测，而且额外引入一个错配并不能完全抑制非特异扩增。taqman-mgb技术是通过在探针的3’端使用mgb淬灭基团来提高探针特异性，mgb探针采用不发荧光的淬灭基团(nfq)，可极大消除传统淬灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，但在实际应用中其特异性不够理想，不能有效区分只有1个碱基差异的smn1和smn2。微滴式数字pcr定量，通过设计特异性引物，可实现对拷贝数的绝对定量，结果判读简单，但是其仪器和耗材等价格昂贵，操作较为复杂，不太适合临床应用。多重连接探针扩增技术（multiplex?ligation-dependent?probe?amplification，mlpa），高效、特异，可以明确区分患者、携带者及正常人，同时检测患者的smn2拷贝数，是临床sma基因检测金标准。但操作流程复杂、实验耗费时间较长、实验结果判读相对复杂，商品化试剂价格高昂，尚不适用于人群的大量筛查。pcr-dhplc，具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测dna片段和长度变动范围广、相对价廉等优点?？梢悦魅非只颊?、携带者及正常人，也可以检测患者的smn2拷贝数，但存在实验引物设计较为复杂、实验背景受重复片段干扰较大、结果判读困难等缺点，并且对实验检测条件要求高。二代测序，主要是根据c.840c>t分析smn1?reads与smn2?reads比例，得出smn1与smn2的拷贝数，灵敏度和特异性大于98%，但是对于smn2拷贝数的灵敏度与特异性未明确描述，且ngs成本高、操作较为复杂、检测时间也相对较长。

4、迄今为止，国内注册证产品均是采用荧光pcr的方法，但都是1管反应只能检测1个位点，比如检测smn1外显子7和8的拷贝数，需要2管反应，就需要2倍的试剂成本和样本量，同时1个样本2管反应也降低了检测通量；且都没有检测smn2拷贝数，在sma患者临床分型方面会有一定的缺陷。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种基于2-δδct方法检测smn1基因和smn2基因拷贝数的试剂盒，所述试剂盒在一管pcr反应中同时检测smn1基因外显子7、8和smn2基因外显子7拷贝数，其中检测smn1基因外显子7、8和smn2基因外显子7的引物和探针如下：

2、。

3、在一种实施方式中，所述试剂盒还包括检测内参基因cftr的引物和探针，所述引物和探针如下：

4、。

5、在一种实施方式中，所述试剂盒还包括对照品i和空白对照，其中对照品i是smn1基因和smn2基因拷贝数均为2的正常人类基因组dna，和空白对照为无酶水。

6、在一种实施方式中，提供一种上述试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：

7、步骤1：提取样本基因组dna，要求浓度＞2ng/μl，od260/280、od260/230在1.6~2.0之间；

8、步骤2：将pcr反应液、引物探针、模板dna和水在反应管混匀后，将反应管放入荧光定量pcr仪中进行pcr反应；

9、步骤3：荧光定量pcr仪检测反应管产生的荧光强度，通过比较ct法计算反应管中相应靶标的相对拷贝数，判断标准如下：

10、。

11、在一种使用方法中，步骤2中，所述pcr扩增反应程序如下：

12、。

13、在本发明中，只需一管反应液就可以同时得到smn1基因外显子7和外显子8、smn2基因外显子7的相对拷贝数，成本可控、节约样本的同时，既可达到区分sma患者、携带者和正常人的目的，还可实现对患者临床分型的初步判断。

14、本发明针对smn1和smn2外显子7、8的差异突变位点（c.840?c>t和c.*239g>a）的差异位点设计引物探针。因为smn1和smn2基因99%同源，所以在差异位点的两侧分别设计共用pcr引物，并针对差异位点设计特异性荧光pcr探针，探针的3’末端连接一个小沟结合物mgb，由于探针中加入了mgb?部分，可以增加探针的熔解温度?(tm)?10-15℃。这意味着taqman?mgb?探针可以比传统探针短很多，提供更好的序列鉴别能力和灵活性，可适应更多靶标，mgb探针相较于普通taqman探针序列更短，因此荧光基团淬灭更加完全，从而降低荧光背景，提高信噪比。

15、本发明采用taqman探针，三个靶标单纯mgb探针检测均能检测到同源基因，但是特异性不够理想，在采用taqman探针基础上，本发明同时在探针上添加lna修饰，设计合成添加不同数量和位置的lna修饰的探针，经过筛选得到特定位置和数量的lna修饰的探针，彻底阻滞同源基因的干扰，提升了探针的特异性，减少smn1基因与smn2基因之间的相互干扰。

16、在多重pcr反应体系中，通过保证三个靶标和内参基因的相对拷贝数具有协同性，保证定量结果的准确性。本发明通过扩增效率一致性分析（扩增效率e均在?90~110%区间，线性相关系数r2>0.99）及临床样本（已知mlpa结果）检测结果的准确性来评估引物探针，筛选出了一组一致性最好（cv＜5%）且最准确的组合，在本发明的smn1-ex7、smn2-ex7、smn1-ex8和cftr的引物探针组合中，扩增效率一致性cv为4.7%，相关系数r2>0.99，检测准确率100%。

17、内参基因与靶标基因扩增效率的一致性会影响相对拷贝数检测的准确性，所以针对常见内参基因gapdh、β-actin、rpp40、rpp30、cftr等基因的不同保守区域设计了引物探针，最后选定了cftr作为内参基因，该内参基因与三个靶标基因扩增效率的一致性高，保证了相对拷贝数检测的准确性。