用于治疗神经纤维瘤疾患的组合物和方法与流程

背景技术：

1、神经纤维瘤病2(nf2)是一种罕见的遗传性疾患，由编码肿瘤阻抑蛋白merlin的nf2基因中的种系突变引起。这些突变导致merlin蛋白缺陷，merlin蛋白调节细胞过程，包括接触抑制、增殖和凋亡。nf2的特点是生长缓慢的肿瘤，诸如：神经鞘瘤(由施万细胞产生)、脑膜瘤(由蛛网膜细胞产生)、室管膜瘤(由室管膜细胞产生)以及青少年白内障和视网膜错构瘤。

2、nf2的典型表现包括双侧前庭神经鞘瘤，这是发生在第八脑神经上的多小叶肿块。前庭神经鞘瘤导致听力丧失、耳鸣、耳聋、头晕和失去平衡?；颊咄ǔ；嵋蛭琢錾さ挠跋?包括对耳朵的耳毒性作用，导致内耳中与声音感觉有关的细胞死亡)或治疗肿瘤的干预措施(包括部分或完全切除听觉神经)而变得耳聋。如果不加以控制，这些肿瘤最终会压迫脑干并导致死亡。其他症状可能包括毁容、面部无力、头痛和视力丧失。

3、几乎所有受影响的个体都在30岁前出现这些神经鞘瘤。对于患有散发性nf2的个体(略多于一半)，nf2诊断的平均年龄在18至24岁之间。nf2患者的预期寿命为69岁，比一般人群的预期寿命短11年。

4、患有nf2的患者终生有80％的可能性发展脑膜瘤。脑膜瘤发生在脑膜、大脑或脊髓的内层，并且起源于蛛网膜细胞。这些患者出现的患脑膜瘤的中位数量为三个。超过33％的肿瘤特征为显著生长(>1mm/年)。此外，由于nf2基因的体细胞突变，脑膜瘤也可能发生在散发性(非nf2)患者中。散发性脑膜瘤是最常见的脑肿瘤(占所有脑肿瘤的约35％)，并且可能因压迫大脑或脊柱而导致神经功能缺损。脑膜瘤的发生是nf2患者永久性发病和死亡的最大驱动因素。

5、目前还没有fda批准的用于脑膜瘤的药物。目前的护理标准包括手术或放射治疗。对于完全切除的脑膜瘤来说，复发并不常见。相反，次全切除与高复发率相关。对于患有非手术脑膜瘤的患者来说，放射治疗是一个合理的选择。然而，辐射与继发性癌症发病率增加有关，这在肿瘤抑制综合征的背景下尤其成问题。因此，许多临床医生尽量减少在nf2患者、特别是年轻患者中使用放射治疗。

6、nf2患者发生脊髓室管膜瘤的风险增加。这些肿瘤起源于室管膜细胞，并且通常发生在脑干或脊柱内。室管膜瘤常呈“珍珠串”状出现，在颈椎有多个病变。只有一部分室管膜瘤需要治疗。标准方法是手术切除，并针对手术切除后复发的病变保留放射治疗。

7、除了第八脑神经(cn8)或前庭蜗神经之外，nf2患者通常在其他脑神经上出现神经鞘瘤，包括：cn3：动眼神经、cn4：滑车神经、cn5：三叉神经、cn6：外展神经、cn7：面部神经、cn9：舌咽神经、cn10：迷走神经、cn11：脊副神经、cn12：舌下神经。这些神经的任何损伤或功能丧失都可能导致头颈部出现多种疾病。

8、nf2患者还可能出现多种眼睛病症，包括：白内障、视网膜脱离、眼神经损伤、视神经乳头水肿(视盘水肿)、眼型偏头痛(视网膜偏头痛)、视网膜色素变性(rp)(视网膜变性)、视网膜和rpe复合错构瘤、视网膜微动脉瘤、视网膜前膜结膜炎、physiopedia(严重干眼)、眼球震颤-视振荡(眼球扑动/交叉)、复视(双视)、和凝视诱发耳鸣(get)。

9、因此，需要用于治疗nf2患者的组合物和方法。本实施方式满足了这些需求以及其他需求。

技术实现思路

1、在一些实施方式中,提供了一种腺相关病毒(aav)，其包括腺相关病毒衣壳蛋白和转基因，所述转基因编码全长merlin蛋白或其一个或多个活性片段，诸如但不限于，merlin同种型1的残基1-359、merlin同种型1的残基1-313、merlin同种型1的残基1-219、merlin同种型1的残基1-73、merlin同种型1的残基312-595、merlin同种型1的残基479-595、merlin同种型1的残基503-595或其组合。

2、在一些实施方式中，提供了包括本文所提供的aav的组合物。

3、在一些实施方式中，提供了包括本文所提供的aav和药学上可接受的载体的药物组合物。

4、在一些实施方式中，将merlin蛋白递送至细胞的方法，所述方法包括使细胞与本文所提供的aav接触的步骤。

5、在一些实施方式中，治疗患有nf2的受试者的方法，所述方法包括向患有nf2的受试者给药本文所提供的aav。

6、在一些实施方式中，抑制受试者中神经鞘瘤、脑膜瘤或室管膜瘤生长的方法，所述方法包括给药本文所提供的aav。

7、在一些实施方式中，预防受试者中神经鞘瘤、室管膜瘤或脑膜瘤生长或形成的方法，所述方法包括向受试者给药本文所提供的aav。

8、在一些实施方式中，治疗患有与merlin缺陷相关的疾患(例如，2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病或癌症)或具有患该疾患的风险的受试者的方法，所述方法包括向受试者给药本文所提供的aav。

9、在一些实施方式中，本文提供了包括与seq?id?no:2至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的核酸分子，或编码merlin蛋白或其活性片段的核酸序列。

10、在一些实施方式中，提供了包括本文所提供的核酸分子和载体的组合物。

11、在一些实施方式中，提供了产生如本文所提供的aav的方法，所述方法包括使细胞与如本文所提供的核酸分子接触以产生aav。

1.一种腺相关病毒(aav)，包括aav衣壳蛋白和转基因，所述转基因编码全长merlin蛋白(例如merlin同种型1或merlin同种型2)或其一个或多个活性片段，诸如但不限于，merlin同种型1的残基1-359、merlin同种型1的残基1-313、merlin同种型1的残基1-219、merlin同种型1的残基1-73、merlin同种型1的残基312-595、merlin同种型1的残基479-595、merlin同种型1的残基503-595或其组合。

2.根据权利要求1所述的aav，其中，所述转基因位于aav反向末端重复内。

3.根据权利要求1或2所述的aav，其中，所述转基因可操作地连接至指导异源基因在宿主细胞中表达的调控序列。

4.根据权利要求3所述的aav，其中，所述调控序列包括启动子。

5.根据权利要求4所述的aav，其中，所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子，诸如但不限于神经元或神经元组织特异性启动子，包括但不限于本文提供的那些。

6.根据权利要求5所述的aav，其中，所述启动子是cag启动子、cmv启动子、cba启动子或sv40启动子。

7.根据前述权利要求中任一项所述的aav，其中，所述衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白。

8.根据权利要求7所述的aav，其中，所述aav9衣壳蛋白包括具有以下氨基酸序列的蛋白质：

9.根据权利要求7所述的aav，其中，所述aav9衣壳包括与seq?id?no:3的氨基酸残基203至736至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

10.根据前述权利要求中任一项所述的aav，其中，由所述转基因编码的merlin蛋白包括与seq?id?no:1或seq?id?no:8的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或同源的序列。

11.根据前述权利要求中任一项所述的aav，其中，由所述转基因编码的merlin蛋白包括seq?id?no:1或seq?id?no:8的序列或其活性片段。

12.根据前述权利要求中任一项所述的aav，其中，所述转基因包括编码包括seq?idno:1或seq?id?no:8的序列的蛋白质或其活性片段的核酸分子。

13.根据权利要求12所述的aav，其中，编码merlin蛋白的核酸分子包括seq?id?no:2、seq?id?no:9的核酸序列或其各自的密码子优化形式。

14.根据权利要求2所述的aav，其中，所述aav反向末端重复是aav-2反向末端重复。

15.根据权利要求14所述的aav，其中，aav2反向末端重复包括seq?id?no:4的序列。

16.根据前述权利要求中任一项所述的aav，其中，所述aav包括位于所述转基因上游和5'(左侧)aav?itr下游的核酸分子填充序列。

17.根据权利要求16所述的aav，其中，所述填充序列包括seq?id?no:6的序列。

18.根据前述权利要求中任一项所述的aav，其中，所述aav包括位于所述转基因下游和右侧(3')aav(例如，aav2)itr上游的核苷酸内含子序列。

19.根据权利要求18所述的aav，其中，所述内含子序列是hpre序列。

20.根据权利要求19所述的aav，其中，所述hpre序列包括seq?id?no:5的序列。

21.一种组合物，包括权利要求1-20中任一项所述的aav和生理相容性载体。

22.一种药物组合物，包括权利要求1-20中任一项所述的aav和药学上可接受的载体。

23.一种将merlin蛋白递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-20中任一项所述的aav或权利要求21或22所述的组合物接触的步骤。

24.一种治疗患有nf2的受试者的方法，所述方法包括向所述患有nf2的受试者给药权利要求1-20中任一项所述的aav或权利要求21或22所述的组合物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述给药是室内、脑池内、鞘内、纹状体内、胸膜内、肌内、玻璃体内、静脉内或瘤内。

26.一种抑制受试者中神经鞘瘤、脑膜瘤或室管膜瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-20中任一项所述的aav或权利要求21或22所述的组合物。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述受试者是患有nf2或nf2缺陷性疾患诸如神经鞘瘤病的受试者。

28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述给药是鞘内、静脉内、室内、纹状体内、胸膜内、肌内、脑池内或瘤内。

29.一种预防受试者中神经鞘瘤、室管膜瘤或脑膜瘤生长或形成的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-20中任一项所述的aav或权利要求21或22所述的组合物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述受试者是患有nf2或nf2缺陷性疾患诸如神经鞘瘤病的受试者。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述给药是鞘内、静脉内、脑池内或瘤内。

32.一种治疗患有与merlin缺陷相关的疾患(例如，2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病或癌症)或具有患所述疾患的风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-20中任一项所述的aav或权利要求21或22所述的组合物。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述疾患是2型神经纤维瘤病、神经鞘瘤病、神经鞘瘤(例如，前庭神经鞘瘤)；癌症(例如，血液癌症(例如，幼年粒单核细胞白血病)、白血病(例如，成人急性淋巴细胞白血病、儿童急性淋巴细胞白血病、成人急性髓细胞白血病、儿童急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病，或毛细胞白血病)；淋巴瘤(例如，aids相关淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、成人霍奇金淋巴瘤、儿童霍奇金淋巴瘤、成人非霍奇金淋巴瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、塞扎里综合征、皮肤t细胞淋巴瘤、皮肤华氏巨球蛋白血症)；慢性骨髓增生性疾患；朗格汉斯细胞组织细胞增多症；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤)；卵巢癌(例如，卵巢浆液性癌)；乳腺癌、浸润性乳腺癌；或神经皮肤疾患；(例如，间皮瘤、腹膜间皮瘤、皮肤鳞状细胞癌、泌尿道癌、甲状腺癌、胃癌、神经鞘瘤、肾细胞癌、垂体癌、卵巢癌、脑膜瘤、黑色素瘤、肺癌(例如，鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、混合型肺癌、肺腺癌)、肝癌、大肠癌、肝细胞癌、急性髓性白血病(aml)、呼吸消化道癌(鳞状细胞癌)、膀胱癌、骨癌(例如，骨肉瘤)、结直肠癌、室管膜瘤、结直肠癌、子宫内膜瘤(混合性腺鳞癌)或神经胶质瘤、或白内障、视网膜脱离、眼神经损伤、视神经乳头水肿(视盘水肿)、眼型偏头痛(视网膜偏头痛)、视网膜色素变性(rp)(视网膜变性)、视网膜和rpe复合错构瘤、视网膜微动脉瘤、视网膜前膜结膜炎、physiopedia(严重干眼)、眼球震颤-视振荡(眼球扑动/交叉)、复视(双视)、或凝视诱发耳鸣(get)。

34.根据权利要求23-33中任一项所述的方法，其中，至少每6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、2年、三年、四年、五年、六年或更久给药所述aav。

35.根据权利要求23-34中任一项所述的方法，其中，静脉内、真皮内、皮下、鞘内、全身、脑池内、室内、实质内、胸膜内、纹状体内、肌内、玻璃体内或局部给药所述aav。

36.一种核酸分子，包括与seq?id?no:2至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或相同的序列。

37.根据权利要求30所述的核酸分子，其中，所述核酸分子是分离的核酸分子。

38.根据权利要求36或37所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括seqid?no:2的序列。

39.根据权利要求36-39中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括aav反向末端重复。

40.根据权利要求39所述的核酸分子，其中，所述seq?id?no:2的序列结合在所述aav反向末端重复内。

41.根据权利要求39或40所述的核酸分子，其中，所述aav反向末端重复是aav2反向末端重复。

42.根据权利要求41所述的核酸分子，其中，所述aav2反向末端重复之一(例如，3’aavitr)包括seq?id?no:4的序列。

43.根据权利要求36-42中任一项所述的核酸分子，其中，包括seq?id?no:2的核酸可操作地连接至指导seq?id?no:2编码的蛋白质的表达的调控序列。

44.根据权利要求44所述的核酸分子，其中，所述调控序列包括启动子。

45.根据权利要求44所述的核酸分子，其中，所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子。

46.根据权利要求37或38所述的核酸分子，其中，所述启动子是cag启动子、cmv启动子或sv40启动子。

47.根据权利要求36-46中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括位于seqid?no:2转基因上游和5’(左侧)aav?itr下游的填充序列。

48.根据权利要求47所述的核酸分子，其中，所述填充序列包括seq?id?no:6的序列。

49.根据权利要求36-48中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括位于seqid?no:2下游和右侧(3')aav(例如aav2)itr上游的核苷酸内含子序列。

50.根据权利要求49所述的核酸分子，其中，所述内含子序列是hpre内含子序列。

51.根据权利要求50所述的核酸分子，其中，所述hpre内含子序列包括seq?id?no:5的序列。

52.根据权利要求36-51中任一项所述的核酸分子，其中，所述分子是质粒。

53.一种组合物，包括权利要求36-52中任一项所述的核酸分子和载体。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中，所述载体是转染试剂。

55.一种产生权利要求1-20中任一项所述的aav颗粒的方法，所述方法包括使细胞与根据权利要求36-52中任一项所述的核酸分子或权利要求53或54所述的组合物接触(例如转染或电穿孔)以产生aav。

56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述细胞属于aav包装细胞系。

57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述aav包装细胞系是aav9包装细胞系。

58.一种培养的宿主细胞，其包括编码aav衣壳蛋白的重组核酸分子和编码merlin蛋白的重组核酸分子。

59.根据权利要求58所述的细胞，其中，所述衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白。

60.根据权利要求58或59所述的细胞，其中，所述编码衣壳蛋白的核酸分子编码与具有以下氨基酸序列的蛋白质至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或相同的蛋白质：seq?id?no:3的氨基酸残基1至736；seq?id?no:3的氨基酸残基138至736；或seqid?no:3的氨基酸残基203至736。

61.根据权利要求58-60中任一项所述的细胞，其中，所述编码merlin蛋白的重组核酸分子编码与seq?id?no:1、seq?id?no:8的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或同源、或相同的蛋白质或其活性片段。

62.根据权利要求58-61中任一项所述的细胞，其中，所述编码merlin蛋白的重组核酸分子编码包括seq?id?no:1、seq?id?no:8的序列的蛋白质或其活性片段。

63.根据权利要求58-62中任一项所述的细胞，其中，所述编码merlin蛋白的重组核酸分子包括与seq?id?no：2或seq?id?no:9至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

64.根据权利要求58-63中任一项所述的细胞，其中，所述编码merlin蛋白的重组核酸分子包括seq?id?no:9的seq?id?no:2的序列。

65.根据权利要求58-64中任一项所述的细胞，其中，所述重组核酸分子是质粒。