修饰的κ轻链-结合多肽的制作方法

本技术涉及与免疫球蛋白或其片段结合的多肽。更具体地说，它涉及具有高结合亲和力和改进的碱稳定性的κ轻链结合多肽。

背景技术：

1、免疫球蛋白和免疫球蛋白片段代表全世界生产或开发的最普遍的生物制药产品。对于这种特定治疗市场的高商业需求，以及由此其价值，已导致重点放在制药公司上，以使它们各自的生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。

2、亲和色谱，通常在包含葡萄球菌蛋白a或其变体的基质上，通常被用作在完整免疫球蛋白分子的纯化中的关键步骤之一。蛋白a对免疫球蛋白的fc链的高选择性结合提供一个对杂质和污染物具有很高的清除作用的通用步骤。

3、对于抗体片段，例如fab、单链可变片段(scfv)、双-特异性t-细胞衔接子(bite)、结构域抗体等，其缺乏fc链但具有κ轻链1、3或4子类，包含源自大消化链球菌(peptostreptococcus?magnus)的蛋白l的基质(blj.biol.chem.264,19740-19746,1989；w?kastern?et?al:j.biol.chem.267,12820-12825,1992；b?hknilsonet?al:j.biol.chem.267,2234-2239,1992和30美国专利6,822,075)用作提供所需的高选择性的纯化平台。

4、蛋白l基质是可作为例如来自cytivatm的captotm?l经商业获得的，并可被用来分离含κ轻链的蛋白例如完整抗体、fab片段、scfv片段、结构域抗体等。约75％的由健康人类产生的抗体具有κ轻链，并且约90％的治疗性单克隆抗体和抗体片段含有κ轻链(carter,p.,lazar,g.next?generation?antibody?drugs:pursuit?ofthe'high-hanging?fruit'.nat?rev?drug?discov?17,197–223(2018).https://doi.org/10.1038/nrd.2017.227)。

5、蛋白l是一种76–106kda的蛋白质，含有四个或五个高度同源的连续细胞外ig结合结构域，这取决于从中分离它的细菌菌株。大消化链球菌(peptostreptococcus?magnus)菌株312中的蛋白l基因包含多个组分，包括18aa的信号序列、90aa的氨基末端区域，接着是5个同源的抗体结合结构域。在captotml产品中，配体由功能结构域b1-b4组成(wo?00/15803a1)。此外，大消化链球菌菌株3316产生同源的蛋白l，其由四个称为c1-c4的igg结合结构域组成。在genbank数据库中发现了另一种同源蛋白，被认为是“假定的蛋白”，在本文称为d结构域。

6、任何生物处理色谱应用需要全面注意污染物的明确去除。这样的污染物可以是例如在色谱程序中吸附于固定相或基质的非洗脱分子，例如非期望的生物分子或微生物，包括例如蛋白、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。从基质去除这样的污染物通常在首次洗脱期望的产物后执行，以在后续使用之前再生基质。这样的去除通常涉及称为原位清洗(cip)的程序，其中使用能够从固定相洗脱污染物的试剂。一类常常与色谱介质一起使用的这样的试剂是碱性溶液，其在基质上通过。目前最广泛使用的清洁和消毒剂是naoh，并且理想的是以范围从0.05至最多例如1m的浓度使用，这取决于污染的程度和性质。然而，与例如蛋白a比较，蛋白l是一种对碱相当敏感的蛋白，并且以90％的剩余结合容量，使用15分钟接触时间，仅耐受15mm?naoh?80个循环。由于树脂的容量损失，另外的较不理想的清洁溶液，例如尿素或胍鎓盐，也可能必须使用，以确保足够的清洁。

7、因此，本领域存在获得含有蛋白l-衍生的配体的分离基质的需要，所述配体对碱性清洁程序具有改进的稳定性。

技术实现思路

1、发明人的目标是提供具有高碱稳定性的蛋白l配体。发明人进一步的目标是提供至少保持亲和力和选择性的蛋白l配体。

2、通过提供一种κ轻链-结合多肽实现所述目标，该多肽由消化链球菌属(peptostreptococcus)蛋白l的至少一个突变结合结构域组成，基本上由消化链球菌属蛋白l的至少一个突变结合结构域组成，或包含消化链球菌属蛋白l的至少一个突变结合结构域，所述结构域与氨基酸序列seq?id?no:10、seq?id?no:11、seq?id?no:12、seq?id?no:13、seq?id?no:14、seq?id?no:15、seq?id?no:16、seq?id?no:17或seq?id?no:18中的任何一个具有至少90％、95％或98％的序列同一性，或77.5％的序列相似性，如通过75的blosum矩阵确定的，其中空位开放罚分为12，空位延伸罚分为3，并且其中相对于seq?id?no:10-18中的任何一个，所述多肽在位置6和41中每一个的天冬酰胺突变为组氨酸，并且在位置56的天冬酰胺突变为酪氨酸或谷氨酰胺。

3、消化链球菌属蛋白l的结合结构域与氨基酸序列seq?id?no:1、seq?id?no:2、seqid?no:3、seq?id?no:4、seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7或seq?id?no:8中的任何一个可具有至少90％、95％或98％的序列同一性，或77.5％的序列相似性，如通过75的blosum矩阵确定的，其中空位开放罚分为12，空位延伸罚分为3，并且其中相对于seq?idno:1-4和6-9，所述多肽在位置10和45中每一个的天冬酰胺突变为组氨酸，并且在位置60的天冬酰胺突变为酪氨酸或谷氨酰胺；或

4、与seq?id?no:9具有至少90％、95％或98％的序列同一性，或77.5％的序列相似性，如通过75的blosum矩阵确定的，其中空位开放罚分为12，空位延伸罚分为3，并且其中相对于seq?id?no:5，所述多肽在位置9和44中每一个的天冬酰胺突变为组氨酸，并且在位置59的天冬酰胺突变为酪氨酸或谷氨酰胺。

5、消化链球菌属蛋白l的结合结构域可以选自b2结构域、b3结构域、b4结构域、c2结构域、c3结构域、c4结构域和d1结构域。优选地，消化链球菌属蛋白l的结合结构域选自b3结构域、c2结构域、c3结构域和d结构域。

6、所述结构域与序列seq?id?no:3、seq?id?no:6或seq?id?no:7中的任何一个可具有90％、95％或98％的序列同一性，或77.5％的序列相似性，如通过75的blosum矩阵确定的，其中空位开放罚分为12，空位延伸罚分为3。

7、c2结构域可以是其中另外地，在位置57的天冬酰胺已突变为酪氨酸或谷氨酰胺，例如酪氨酸的结构域。该结构域与seq?id?no:31或seq?id?no:32可具有90％、95％或98％的序列同一性，或77.5％的序列相似性，如通过75的blosum矩阵确定的，其中空位开放罚分为12，空位延伸罚分为3。

8、c3结构域可以是其中另外地，在位置57的天冬酰胺已突变为酪氨酸或谷氨酰胺，例如酪氨酸，并且在位置39的天冬酰胺已突变为天冬氨酸的结构域。该结构域与seq?idno:33或seq?id?no:34可具有90％、95％或98％的序列同一性，或77.5％的序列相似性，如通过75的blosum矩阵确定的，其中空位开放罚分为12，空位延伸罚分为3。

9、所述多肽与序列seq?id?no:21、seq?id?no:22、seq?id?no:23、seq?id?no:24、seqid?no:25、seq?id?no:26、seq?id?no:27、seq?id?no:28、seq?id?no:29、seq?id?no:30、seqid?no:35、seq?id?no:36、seq?id?no:37、seq?id?no:38、seq?id?no:39、seq?id?no:40、seqid?no:41、seq?id?no:42、seq?id?no:43、seq?id?no:44、seq?id?no:45、seq?id?no:46、seqid?no:47、seq?id?no:48、seq?id?no:49、seq?id?no:50、seq?id?no:41、seq?id?no:52、seqid?no:53、seq?id?no:54、seq?id?no:55、seq?id?no:56、seq?id?no:57、seq?id?no:58、seqid?no:59或seq?id?no:60中的任何一个可具有90％、95％或98％的序列同一性，或77.5％的序列相似性，如通过75的blosum矩阵确定的，其中空位开放罚分为12，空位延伸罚分为3。

10、优选地，所述多肽与序列seq?id?no:21、seq?id?no:22、seq?id?no:35、seq?idno:36、seq?id?no:37、seq?id?no:38、seq?id?no:47、seq?id?no:48、seq?id?no:53、seq?idno:54、seq?id?no:55或seq?id?no:56中的任何一个，例如与序列seq?id?no:21、seq?idno:22、seq?id?no:47或seq?id?no:48中的任何一个具有90％、95％或98％的序列同一性，或77.5％的序列相似性，如通过75的blosum矩阵确定的，其中空位开放罚分为12，空位延伸罚分为3。

11、所述κ轻链-结合多肽还可包含指定氨基酸序列的n-末端或c-末端的间隔物或接头，和/或指定氨基酸序列的n-末端或c-末端的额外氨基酸。所述κ轻链-结合多肽还可包含在n-末端的多个氨基酸残基，这些残基来源于克隆过程或构成来自切掉的信号序列的残基，其中额外氨基酸残基的数量为15个或更少，例如10个或更少，或5个或更少。

12、所述κ轻链-结合多肽优选与κ1、κ3和κ4结合。

13、本文还提供了多聚体，其包含至少两个根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个多肽。多聚体还可以包含接头、间隔物或额外氨基酸。

14、本文还提供了编码根据上述的多肽或多聚体的核酸。

15、另外提供了载体，其包含根据上述的核酸，任选地还包含信号肽、增强子、启动子、鉴定标签、鉴定标记、选择标记和/或纯化标签中的一种或多种。

16、本公开还提供了包含根据上述的核酸或载体的表达系统。

17、此外，本公开提供了分离基质，其包含与固体支持物偶联的根据上述的至少一种多肽或至少一种多聚体。

18、本公开的优选方面在下面的详细描述和从属权利要求中描述。

19、定义

20、术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此可互换使用，并被理解为还包括抗体的片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白和包含抗体或抗体片段的缀合物。

21、术语“κ轻链-结合多肽”和“κ轻链-结合蛋白”在此分别指能够结合抗体的1、3或4子类κ轻链(也称为vκi、vκiii和vκiv，如在b?hknilson?et?al:j.biol.chem.267,2234-2239,1992中)的多肽或蛋白，并包括例如蛋白l，及其已维持所述结合特性的任何变体、片段或融合蛋白。

22、术语“含κ轻链的蛋白”被用作“含免疫球蛋白κ轻链的蛋白”的同义词，并且在此意指包含从抗体衍生的1、3或4子类κ轻链(也称为vκi、vκiii和vκiv，如在b?hknilson?et?al:j.biol.chem.267,10?2234-2239,1992中)的蛋白，并包括含有1、3或4子类κ轻链的任何完整抗体、抗体片段、融合蛋白、缀合物或重组蛋白。

23、术语“接头”在本文中是指在多聚体中将两个多肽单元、单体或结构域相互连接的元件。

24、术语“间隔物”在本文中是指将多肽或多肽多聚体连接到支持物的元件。